تحليل كروماتوغرافي سائل عالي الأداء (HPLC) هو أسلوب كروماتوغرافي عمود يكون فيه الطور المتحرك (MP) عبارة عن سائل يتحرك عبر عمود كروماتوغرافي مملوء بمرحلة ثابتة (مادة ماصة). تتميز أعمدة HPLC بالضغط الهيدروليكي العالي عند مدخل العمود، ولهذا السبب يُطلق على HPLC أحيانًا اسم "كروماتوغرافيا السائل عالي الضغط".

اعتمادًا على آلية فصل المواد، يتم تمييز خيارات HPLC التالية: الامتزاز، والتقسيم، والتبادل الأيوني، واستبعاد الحجم، والكيرالي، وما إلى ذلك.

في كروماتوغرافيا الامتزاز، يحدث فصل المواد نتيجة لقدرتها المختلفة على الامتزاز والامتصاص من سطح مادة ماصة ذات سطح متطور، على سبيل المثال، هلام السيليكا.

في قسم HPLC، يحدث الانفصال بسبب الاختلاف في معاملات التوزيع للمواد التي يتم فصلها بين الطور الثابت (عادةً المطعمة كيميائيًا على سطح حامل ثابت) والطور المتحرك.

بناءً على القطبية، يتم تقسيم PF وNP HPLC إلى طور عادي وطور عكسي.

الطور العادي هو أحد أشكال الكروماتوغرافيا التي تستخدم مادة ماصة قطبية (على سبيل المثال، هلام السيليكا أو هلام السيليكا مع مجموعات NH 2 أو CN المطعمة) وPF غير قطبي (على سبيل المثال، الهكسان مع إضافات مختلفة). في نسخة الطور العكسي من الفصل اللوني، يتم استخدام المواد الماصة غير القطبية المعدلة كيميائيًا (على سبيل المثال، جذري الألكيل غير القطبي C 18) والأطوار المتحركة القطبية (على سبيل المثال، الميثانول، الأسيتونيتريل).

في كروماتوغرافيا التبادل الأيوني، يتم فصل جزيئات خليط المواد المنفصلة في المحلول إلى كاتيونات وأنيونات، عند تحركها عبر مادة ماصة (مبادل كاتيوني أو مبادل أنيوني) بسبب اختلاف معدلات التبادل مع المجموعات الأيونية للمادة الماصة.

في الاستبعاد الحجمي (الغربال، نفاذية الهلام، ترشيح الهلام) يتم فصل جزيئات المواد حسب الحجم بسبب قدرتها المختلفة على اختراق مسام الطور الثابت. في هذه الحالة، فإن أكبر الجزيئات (ذات الوزن الجزيئي الأعلى) القادرة على اختراق الحد الأدنى لعدد مسام الطور الثابت هي أول من يغادر العمود، والمواد ذات الأحجام الجزيئية الصغيرة هي آخر من يغادر.

في كثير من الأحيان لا يحدث الانفصال من خلال آلية واحدة، ولكن من خلال عدة آليات في وقت واحد.

يمكن استخدام طريقة HPLC للتحكم في جودة أي مادة تحليلية غير غازية. لإجراء التحليل، يتم استخدام الأدوات المناسبة - الكروماتوجرافيا السائلة.

يشتمل الكروماتوغرافيا السائلة عادة على المكونات الرئيسية التالية:

- وحدة تحضير PF، بما في ذلك حاوية ذات طور متحرك (أو حاويات تحتوي على مذيبات فردية مدرجة في الطور المتحرك) ونظام تفريغ غاز PF؛

– نظام الضخ

- خلاط الطور المتحرك (إذا لزم الأمر)؛

- نظام إدخال العينة (الحاقن)؛

- العمود الكروماتوغرافي (يمكن تركيبه في منظم الحرارة)؛

- الكاشف؛

– نظام جمع ومعالجة البيانات.

نظام الضخ

تزود المضخات PF إلى العمود بسرعة ثابتة معينة. قد يكون تكوين الطور المتحرك ثابتًا أو يختلف أثناء التحليل. في الحالة الأولى، تسمى العملية إيسقراطية، وفي الثانية - التدرج. يتم أحيانًا تركيب المرشحات ذات قطر المسام 0.45 ميكرومتر أمام نظام الضخ لتصفية الطور المتحرك. يتكون نظام ضخ الكروماتوجراف السائل الحديث من مضخة واحدة أو أكثر يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر. يتيح لك ذلك تغيير تركيبة PF وفقًا لبرنامج معين أثناء الشطف المتدرج. يمكن أن يتم خلط مكونات PF في الخلاط عند الضغط المنخفض (قبل المضخات) وعند الضغط العالي (بعد المضخات). يمكن استخدام الخلاط لتحضير PF وأثناء الشطف الإيسقراطي، ومع ذلك، يتم تحقيق نسبة أكثر دقة للمكونات عن طريق الخلط المسبق لمكونات PF للعملية الإيسقراطية. تتيح مضخات HPLC التحليلية الحفاظ على معدل تدفق ثابت لـ PF في العمود في النطاق من 0.1 إلى 10 مل / دقيقة عند ضغط عند مدخل العمود يصل إلى 50 ميجا باسكال. ومع ذلك، فمن المستحسن ألا تتجاوز هذه القيمة 20 ميجا باسكال. يتم تقليل نبضات الضغط إلى الحد الأدنى عن طريق أنظمة المثبط الخاصة المضمنة في تصميم المضخات. الأجزاء العاملة للمضخات مصنوعة من مواد مقاومة للتآكل، مما يسمح باستخدام مكونات عدوانية في تركيبة PF.

1

تم تطوير طريقة HPLC-MS/MS تم التحقق من صحتها لتحديد وقياس مشتقات الأحماض الأمينية 1,3,4-ثياديازول الجديدة LXT7-09. تم تحقيق أقصى حساسية للكشف عن الطيف الكتلي لـ LHT7-09 في وضع الكشف عن الأيونات الموجبة عند جهد رش كهربائي يبلغ 5500 فولت وإمكانية فصل قدرها 36 فولت. أكدت التحولات MRM المحددة التركيب الكيميائي لمشتق الأحماض الأمينية الجديد من 1 ,3,4-ثياديازول. لعزل LXT7-09 بشكل فعال من مخاليط متعددة المكونات من الثيادايازوليلاميدات، تم تطوير وضع متدرج للكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء باستخدام خليط من الأسيتونيتريل والماء منزوع الأيونات بنسب مختلفة كشاطف. بالنسبة لهذه الظروف الكروماتوغرافية، تم تحديد وقت الاحتفاظ بالمركب LHT7-09 ليكون 11 دقيقة. من أجل التحديد الكمي لمركب LHT7-09، تم تطوير محلول معايرة لاعتماد منطقة الذروة الكروماتوغرافية على تركيز المحلول.

HPLC- مللي ثانية/ مللي ثانية

اللوني

قياس الطيف الكتلي

ثاديازول

1. كازايشفيلي يو.جي.، بوبوف إن.إس. دراسة النشاط المضاد للالتهابات لمشتقات الثياديازول الجديدة في وذمة المخلب المحدثة بالفورمالين في الجرذان / Yu.G. كازايشفيلي، ن.س. بوبوف // قضايا معاصرةالعلم والتعليم. – 2013. – رقم 3. شبكة الاتصالات العالمية..

2. مشتقات الثياديازول الجديدة ذات الفعالية المضادة للفطريات / A.S. كوشيفينكو [وآخرون] // التقدم في علم الفطريات الطبية. – 2015. – ت14. – ص348-351.

3. تحضير وفعالية مضاد الأورام لمركبات فيوريل-2 الجديدة المستبدلة 1،3،4-ثياديازول، 1،2،4-ترايازول / T.R. هوفسيبيان [وآخرون] // المجلة الكيميائية الصيدلانية. – 2011. – ت45. – رقم 12. – ص3-7.

4. بوبوف إن إس، ديميدوفا إم إيه. تقييم السمية الحادة لمشتق حمض أميني جديد للثياديازول عند إعطائه داخل الصفاق للفئران / N.S. بوبوف، م. ديميدوفا // مجلة فولغا العليا الطبية. - 2016. - ت.15، العدد. 1. – ص 9-12.

5. بوبوف إن إس، ديميدوفا إم إيه. تقييم التقرحات لمشتق حمض أميني جديد للثياديازول عند إعطائه داخل المعدة للفئران / N.S. بوبوف، م. ديميدوفا // طالبة دراسات عليا. – 2017. – رقم 1(80). – ص 71-78.

6. التوليف والنشاط المضاد للميكروبات لأميدات أحماض فينيلثيو وبنزيل سلفونيل أسيتيك على أساس 2-أمينو-5-ألكيل (أريللكيل) -1،3،4-ثياديازول / S.A. سيركوف [وآخرون] // المجلة الكيميائية الصيدلانية. – 2014. – ت48، العدد 1. – ص24-25.

7. Arpit K.، Basavaraj M.، Sarala P.، Sujeet K.، Satyaprakash K. التوليف والنشاط الدوائي لمشتقات إيميدازوثيادايازول // Acta Poloniae Pharmaceutica، أبحاث المخدرات. 2016. المجلد. 73. لا. 4. ص 937-947.

8. إيمان محمد فليفل، وائل السيد، أشرف محمد محمد، تخليق ونشاط مضاد للسرطان لمركبات 1-ثيا-4-أزاسبيروديكان الجديدة، ومشتقاتها من الثيازولوبيريميدين و1،3،4-ثياديازول ثيوغليكوزيدات // جزيئات. 2017. لا. 22(1). ص170.

9. خورخي ر.أ. دياز، جيراردو إنريكي كامي. تظهر أملاح 5-أمينو-2-سلفوناميد-1،3،4-ثياديازول، وهي هيكلية وتناظرية للأسيتازولاميد، خصائص مثبطة مثيرة للاهتمام للأنهيدراز الكربوني، ومدر للبول، ومضادة للاختلاج // مجلة تثبيط الإنزيمات والكيمياء الطبية. 2016. المجلد. 12. لا. 6. ص1102-1110.

10. Naiyuan Chen، Wengui D.، Guishan L.، Luzhi L. التوليف والنشاط المضاد للفطريات لمركبات 1،3،4-ثياديازول-ثيازوليدينون القائمة على حمض ديهيدروبيتيك // التنوع الجزيئي. 2016. المجلد. 20. لا. 4. ص 897-905.

11. يمنى، إبراهيم الجزار، حنان جورجي، شاهندة م. المسيري. تخليق وتقييم بيولوجي ودراسة النمذجة الجزيئية لمشتقات (1,2,4-ترايازول أو 1,3,4-ثياديازول)-مشتقات ميثيلثيو من كينازولين-4(3H)-واحد كمثبطات DHFR // الكيمياء العضوية الحيوية. 2017. المجلد. 72. ص282-292.

يعد التحليل اللوني السائل عالي الأداء مع الكشف عن قياس الطيف الكتلي أحد أكثر الطرق الواعدة لتحديد الأدوية وتحديدها كميًا في الأجسام البيولوجية المختلفة. تتميز هذه الطريقة بالخصوصية العالية والدقة والقدرة على تحديد المواد بتركيزات قليلة، مما يسمح باستخدامها في التحديد الكمي للأدوية أثناء دراسات الحرائك الدوائية ومراقبة الأدوية، وهو أمر مهم للتشخيص المختبري السريري. ولهذا الغرض، من الضروري تطوير والتحقق من صحة طرق التحديد الكمي لمختلف المواد الطبية، بما في ذلك المواد المبتكرة، استنادًا إلى طريقة HPLC-MS/MS.

الدواء الأصلي من مجموعة مضادات الالتهاب غير الستيرويدية هو أسيكسازولاميد، وهو مشتق جديد من أميد 1،3،4-ثياديازول وحمض أسيكساميك. الميزة الكبيرة لهذا المركب هي سمية منخفضة وقرح منخفضة. لإجراء دراسات الحركية الدوائية وتقييم التوافر البيولوجي لهذا الدواء من خلال طرق مختلفة للإعطاء، من الضروري تطوير طريقة موثوقة لتحديده كميًا في السوائل البيولوجية.

الغرض من هذه الدراسةكان تطوير تقنية لتحديد وتحديد كمي لعقار جديد مضاد للالتهابات غير الستيرويدية من مجموعة مشتقات الثاديازول باستخدام HPLC-MS/MS.

المواد والأساليب

كان الهدف من الدراسة هو مشتق جديد للثياديازول برمز المختبر LHT 7-09، تم تصنيعه في OJSC "VNTs BAV" (Staraya Kupavna) بواسطة البروفيسور. S.Ya. سكاشيلوفا (الشكل 1).

2- (5-إيثيل-1،3،4-ثياديازوليل) أميد 2-حمض أسيتيل أمينوهيكسانويك

أرز. 1. التركيب الكيميائي لـ LHT 7-09 (الصيغة الإجمالية: C 12 H 20ن 4 يا 2س; الكتلة المولية 284,4 جم / مول)

اتصال LHT 7-09 مظهرهو مسحوق أبيض، وهو غير قابل للذوبان عمليًا في الماء، وقابل للذوبان في الكحول، وقابل للذوبان بسهولة في الأسيتونيتريل.

تم استخدام طريقة كروماتوجرافيا سائلة عالية الأداء تم التحقق من صحتها مع طريقة الكشف الطيفي الكتلي (HPLC-MS/MS) لتحديد وقياس LCT 7-09.

تم إجراء تحليل كروماتوجرافي باستخدام كروماتوجرافيا سائلة عالية الأداء Agilent 1260 InfinityII (Agilent Technologies، ألمانيا). تم استخدام عمود تحليلي Agilent Poroshell 120 EC-C18 2.7 ميكرومتر 2.1 × 10 مم في الدراسة. لعزل المركب قيد الدراسة، قمنا بتطوير وضع اللوني التدرج. تم استخدام الأسيتونيتريل والماء منزوع الأيونات وخلات الأمونيوم بنسب مختلفة كسائل.

بالنسبة لقياس الطيف الكتلي، تم استخدام مطياف الكتلة الرباعي الرباعي ABSciexQTrap 3200 MD (ABSciex، سنغافورة) مع مصدر أيون الرذاذ الكهربائي (TurboV مع مسبار TurboIonSpray). تمت معايرة مطياف الكتلة باستخدام محلول اختبار الريسيربين بتركيز 6.1×10 -2 ملغم/لتر.

تم إجراء التحليل الطيفي الكتلي للعينات المدروسة بطريقة الرش الكهربائي مع الحقن المباشر للعينة والشطافة التي يوفرها جهاز الكروماتوجراف. تم إجراء الحقن المباشر لعينات الاختبار في كروماتوجرافيا الكتلة باستخدام مضخة حقنة يبلغ قطرها 4.61 ملم وبسرعة 10 ميكرولتر / دقيقة.

عند تطوير طريقة لتحديد وقياس مشتقات الثياديازول الجديدة، تم اختيار الظروف المثلى للكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء والكشف الشامل. تم أخذ وقت إطلاق المادة من العمود الكروماتوغرافي وانتقال MRM في الاعتبار (تم التسجيل م/ضأيون السلائف على الرباعي التحليلي الأول Q1 و م/ضأيونات المنتج على الرباعي التحليلي الثاني Q3). لقياس LCT 7-09، تم إنشاء رسم بياني للمعايرة في نطاق التركيز من 0.397 إلى 397 نانوغرام / مل.

مثل برمجةتم استخدام AnalystMD 1.6.2.Software (ABSciex).

النتائج والمناقشة

في المرحلة الأولى من الدراسة التجريبية، تم إجراء الكشف الشامل لعينة الاختبار عن طريق إدخالها مباشرة في كاشف الكتلة باستخدام مضخة حقنة. في مرحلة تحضير العينة، تم تحضير محلول LHT 7-09 (500 نانوغرام/مل) في خليط من الأسيتونيتريل والماء المتأين بنسبة 2:1 مع إضافة خلات الأمونيوم (0.1%).

أظهرت التجارب الأولية أنه في وضع تسجيل الأيونات الموجبة، كانت حساسية تحديد LHT 7-09 أعلى، وكان طيف الكتلة أكثر كثافة وأكثر إفادة مما كان عليه في وضع تسجيل الأيونات السالبة. وفي هذا الصدد، في مزيد من الدراسات، تم استخدام وضع التأين الإيجابي فقط.

للحصول على ذروة مكثفة، اخترنا وفقا للشروطالكشف الشامل : الاستقطاب الإيجابي، جهد الرش الكهربائي 5500.0 فولت، إمكانات الإزالة وإمكانية الحقن - 36.0 و6.5 فولت، على التوالي، مع ضغط غاز الستارة 20.0 رطل لكل بوصة مربعة وضغط غاز الانحلال 40.0 رطل لكل بوصة مربعة، السرعة 10 ميكرولتر/دقيقة. وكان نطاق المسح 270-300 دا.

أظهر تحليل طيف الكتلة الذي تم الحصول عليه للرباعي التحليلي الأول Q1 أنه في ظل هذه الظروف، وبسبب إضافة بروتون الهيدروجين، يتكون جزيء بروتوني من المركب المدروس + بقيمة م/ ض 285.2 نعم (الشكل 2).

أرز. 2. الطيف الشامل للجزيء البروتوني LHT 7-09 (في وضع الأيونات الموجبة + المسح)

في الربع التحليلي الثاني Q3، تم تسجيل أيونات المنتج لأيون السلائف بالقيمة م/ض 285.2 نعم. أظهر تحليل طيف الكتلة من الدرجة الثانية وجود العديد من القمم، منها 3 كانت الأكثر كثافة - م/ض 114.2 دا، م/ض 130.2 دا و م/ض 75.1 دا (الشكل 3).

أرز. 3. الطيف الشامل لأيونات المنتج (في وضع المسح الأيوني الموجب، أيون السلائفم/ ض285.2 نعم)

للحصول على إشارة أيونية عالية الكثافة، تم اختيار قيم الطاقة المثلى في خلية الاصطدام Q2 (تم أخذ نطاق الطاقة من 0 إلى 400 فولت في الاعتبار). لأيونات المنتج ذات القيم م/ ض 114.2 دا، 130.2 دا، 75.1 دا، وكانت الطاقة المثلى في خلية الاصطدام 27 فولت، على التوالي؛ 23 فولت و 49 فولت.

ومن المفترض أن المنتج أيون مع القيمة م/ ض 114.2 Da عبارة عن جزء من 5-أمينو-2-إيثيل-1,3,4-ثياديازول، حيث أن تجزئة مشتقات 1,3,4-ثياديازول الأخرى تكشف أيضًا عن أيون منتج له نفس القيمة م/ ض. أيون المنتج ذو معنى م/ ضمن المحتمل أن يكون 130.2 Da عبارة عن جزء بروتوني من حمض الأسيكساميك. وبذلك أكدت نتائج الكشف الكتلي للعينة محل الدراسة التركيب الكيميائي لمشتق 1,3,4-ثياديازول الجديد.

في المرحلة التالية من الدراسة التجريبية، تم تحليل مركب الاختبار بواسطة قياس الطيف الكتلي HPLC.

في وضع HPLC-MS/MS، تم استخدام ظروف التأين التالية: جهد الرش الكهربائي 5500.0 فولت، معدل تدفق الطور المتحرك 400 ميكرولتر/دقيقة، درجة حرارة النيتروجين 400 درجة مئوية، غاز الستارة وضغط تدفق الرش 20.0 و50.0 رطل لكل بوصة مربعة، على التوالي. كانت سرعة تسجيل أطياف الكتلة الواحدة 100 طيف في الثانية. للحصول على الطيف الكتلي الملخص، تم اختيار فترة زمنية تتراوح من 10.5 إلى 11.5 دقيقة على المخطط اللوني؛ بناءً على شدة إشارة أيونات المنتج، تم إنشاء منحنيات الاعتماد الزمني للتيار الأيوني ومنطقة الذروة للإشارات الفردية المقابلة للمركب قيد الدراسة. كان حجم العينة المقدمة في العمود التحليلي 10 ميكرولتر.

لعزل المركب قيد الدراسة، تم استخدام وضع التدرج للكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء، والذي تم ضمانه عن طريق تغيير تكوين الشاطف عند مدخل العمود التحليلي. تم استخدام الأسيتونيتريل والماء منزوع الأيونات وخلات الأمونيوم بنسب مختلفة كسائل. كان اختيار وضع اللوني التدرج يرجع إلى حقيقة أنه في ظل ظروف وضع الشطف المتساوي (بما في ذلك عند استخدام تركيزات مختلفة من الأسيتونيتريل)، لم يكن من الممكن الحصول على ذروة مادة الاختبار ذات الشكل المتماثل مع وقت الاحتفاظ مناسبة للتحليل. وفقا للدراسة، كان وضع العرض الأمثل للشاطف هو: من 0 إلى 4 دقائق، كان تركيز الأسيتونيتريل 1٪؛ من 4 إلى 8 دقائق زيادة خطية في تركيز الأسيتونيتريل إلى 99٪؛ من 8 إلى 12 دقيقة - القسم الإيزوقراطي (1٪ أسيتونيتريل). عند الانتهاء من الدراسة، تم غسل العمود الكروماتوجرافي بمحلول أسيتونيتريل 30٪ لمدة 5 دقائق.

عند استخدام الوضع اللوني الموصوف، تم الحصول على ذروة متناظرة ذات كثافة كافية للمركب المدروس (الشكل 4).

أرز. 4. اللوني LHT 7-09 (عمود تحليلياجيلنتبوروشيل 120 EC-C18 2.7 ميكرومتر 2.1×10 مم؛ وضع اللوني التدرج)

أظهر تحليل المخططات اللونية التي تم الحصول عليها لمحاليل LCT 7-09 بتركيزات مختلفة أن زمن الاحتفاظ (tR) في ظل ظروف الشطف هذه كان 11 دقيقة ولم يعتمد على تركيز المادة قيد الدراسة. وفي هذا الصدد، يمكن استخدام قيمة وقت الاحتفاظ كمعيار إضافي للتأكد من صحة LHT 7-09 في الخلائط متعددة المكونات. ومن الجدير بالذكر أن هذه المعلمات الكروماتوغرافية يمكن استخدامها لتحديد LHT 7-09 ليس فقط باستخدام كاشف الكتلة، ولكن أيضًا باستخدام أجهزة الكشف الأخرى، بما في ذلك القياس الضوئي.

لتحديد كمية مشتق الثاديازول الجديد، تم إنشاء رسم بياني للمعايرة في نطاق التركيز من 0.397 نانوغرام/مل إلى 397 نانوغرام/مل (الشكل 5).

أرز. 5. رسم بياني للمعايرة لتحديد تركيز LCT 7-09 (على طول محور الإحداثي يوجد تركيز LCT 7-09 في نانوغرام/مل، وعلى طول المحور الإحداثي توجد منطقة الذروة في النبضات)

لتطوير محلول المعايرة، تم استخدام محاليل LHT 7-09 بتركيزات 0.397؛ 1.980؛ 3.970؛ 19.8؛ 39.7؛ 198.0; 397.0 نانوجرام/مل. تم وصف اعتماد منطقة الذروة على تركيز المركب المدروس بمعادلة الانحدار التالية:

y= 8.9e 5 ·x 0.499، كانت قيمة معامل الانحدار r=0.9936.

تجدر الإشارة إلى أن محلول المعايرة المطور يسمح بتحديد كمي عالي الدقة للمركب المدروس في نطاق واسع من التركيزات، مما يجعل من الممكن استخدام هذه الطريقة لتقييم جودة المادة الطبية وإجراء دراسات الحركية الدوائية.

وهكذا، كانت نتيجة الدراسة تطوير طريقة لتحديد وتقدير مشتق جديد من الأحماض الأمينية للثياديازول باستخدام HPLC-MS/MS.

الاستنتاجات

1. يتيح HPLC-MS/MS تحديد وتقدير مشتق حمض أميني جديد للثياديازول بدقة عالية.
2. ينبغي إجراء الكشف الشامل عن مشتق الثياديازول الجديد LHT 7-09 في وضع المسح الأيوني الموجب (انتقال MRM - الأيون السلائف Q1 م/ ض 285.2 نعم؛ أيونات المنتج Q3 م/ ض 114.2 دا، م/ ض 130.2 دا و م/ ض 75.1 دا).
3. لعزل LCT 7-09 من مخاليط متعددة المكونات، تم تطوير تقنية كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (العمود التحليلي Agilent Poroshell 120 EC-C18 2.7 ميكرومتر 2.1 × 10 مم؛ أسيتونيتريل شاطف: ماء منزوع الأيونات: خلات الأمونيوم؛ وضع التدرج).

الرابط الببليوغرافي

بوبوف إن إس، ماليجين إيه إس، ديميدوفا إم إيه. تطوير طريقة HPLC-MS/MS لتحديد الهوية وتحديد الكمية لمشتقات الثياديازول الجديدة // المشاكل الحديثة للعلوم والتعليم. – 2017. – رقم 5.;
عنوان URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=26988 (تاريخ الوصول: 01/02/2020). نلفت انتباهكم إلى المجلات التي تصدرها دار النشر "أكاديمية العلوم الطبيعية"

الكلمات الدالة

المنشطات / الدهون / مصل الدم / الملف الأيضي / مخلفات صناعية/ المنشطات / الدهون / مصل الدم / الملف الأيضي / النفايات الصناعية

حاشية. ملاحظة مقال علمي عن العلوم البيطرية، مؤلف العمل العلمي - تشاخوفسكي بافيل أناتوليفيتش، يانتسيفيتش أليكسي فيكتوروفيتش، دميتروشينكو أليسيا إيجوروفنا، إيفانشيك ألكسندر فيكتوروفيتش

تأثير العوامل البشريةله تأثير متعدد الأوجه على جسم الإنسان والحيوان. ونظرا لتأثيرها المعقد، فإن تحديد الآثار السلبية للعوامل الفردية يعد مهمة صعبة إلى حد ما. تم استخدام المنهجية الأيضية، التي تجعل من الممكن التغلب على هذه الصعوبات، لتقييم طبيعة ومدى تأثير النفايات الناتجة عن إنتاج أسمدة البوتاسيوم على الملامح الدهنية لحيوانات التجارب أثناء التحضير عن طريق الأنف مع النفايات الناتجة عن إنتاج أسمدة البوتاسيوم و استهلاك يشرب الماءتم الحصول عليها من مصادر تقع في المنطقة المحتملة لإنتاج البوتاس. تم إجراء فصل الدهون من المصل باستخدام تقنية مطورة خصيصًا تعتمد على استخلاص الطور الصلب، مما يجعل من الممكن إزالة الكوليسترول من العينات. تم تحليل كل عينة بواسطة تحليل كروماتوجرافي سائل عالي الأداء مع الكشف عن قياس الطيف الكتلي (HPLC-MS)، وبعد ذلك تمت معالجة المخططات اللونية الناتجة باستخدام تحليل المكون الرئيسي (PCA) والتحليل العنقودي. تتيح التقنية المطورة فصل المستقلبات الكارهة للماء بشكل فعال في مصل الدم. تم تحديد صورة الدهون في مصل الدم لدى حيوانات التجارب، وخاصة محتوى الدهون الفوسفاتية والأوكسيستيرويدات، كما تم العثور على اختلافات في عمليات التمثيل الغذائي بين حيوانات التجارب وحيوانات المراقبة. في مصل دم حيوانات التجارب، زاد تركيز الأوكسيستيرويدات مقارنة بالمجموعة الضابطة.

مواضيع ذات صلة الأعمال العلمية في العلوم البيطرية، مؤلف العمل العلمي هو تشاخوفسكي بافيل أناتوليفيتش، يانتسيفيتش أليكسي فيكتوروفيتش، دميتروشينكو أليسيا إيجوروفنا، إيفانشيك ألكسندر فيكتوروفيتش

• استجابة عضيات خلايا الكبد الجرذية للتعرض للمجال المغناطيسي المشكل بالسعة للتردد الصناعي

  2014 / بلكين أناتولي دميترييفيتش، ميشورينا سفيتلانا فيكتوروفنا

• التحديد الانتقائي الشامل للأدوية الهرمونية في اللحوم النيئة. ß-تحليل الناهض

  2016 / كوليكوفسكي أ.ف.، كوزنتسوفا أو.أ.، إيفانكين أ.ن.

• تطبيق كروماتوجرافيا سائلة عالية الأداء لتقدير يوبيكوينون في الكائنات المائية

  2003 / ريبين ف.ج.

• تحديد N7-إيثيل]-جوانين في بول الفئران كعلامة على التعرض لخردل الكبريت

  2017 / أورلوفا أولغا إيغوريفنا، كاراكاشيف جورجي فاسيليفيتش، شموراك فلاديمير إيغوريفيتش، أبزيانيدزه فيكتوريا فلاديميروفنا، سافيليفا إيلينا إيغوريفنا

• تطوير طريقة HPLC-MS لتحليل حمض أورسوديوكسيكوليك في وضع الكشف عن الأيونات الموجبة الشحنة

  2013 / كراسنوف إيليا ألكساندروفيتش، بوبكوف دي. إي.، زايتسيفا إم.، بريسياتش إس. إس.، كراسنوف إن. في.

• تطوير التكنولوجيا لإنشاء جيل جديد من أنظمة الاختبار المعتمدة على الثرومديفينسينات للتشخيص السريع للأمراض المعدية والالتهابية

  2015 / إيفانوف يوري بوريسوفيتش، فاسيلتشينكو أليكسي سيرجيفيتش

• طريقة التحديد المتزامن للكاربامازيبين والكاربامازيبين-10،11-إيبوكسيد بواسطة HPLC-MS/ms

  2015 / رودينا تي إيه، ميلنيكوف إي إس، سوكولوف إيه في، بروكوفييف إيه بي، أرخيبوف في، أداموف جي في، بوزدنياكوف دي إل، أوليفير يو في

• تكوين الأحماض الدهنية والمنشطات من الزيوت النباتية

  2006 / Khasanov V.V.، Ryzhova G.L.، Dychko K.A.، Kuryaeva T.T.

• تطوير والتحقق من صحة طريقة لتحديد الجيدازيبام في المواد البيولوجية باستخدام التحليل الكروماتوغرافي ومطياف الكتلة

  2015 / أ.ف. تشوبينكو، م.أ. سافتشينكو

• تحديد السيكلوسبورين أ في مصل الدم لمراقبة الأدوية العلاجية

  2008 / فيدوروفا جي إيه، بودولسكايا إي بي، نوفيكوف إيه في، ليوتفينسكي يا آي، كراسنوف إن في

تحليل مستويات الدهون في الدم في الخنازير الغينية للكشف المبكر عن التغيرات في عملية التمثيل الغذائي تحت التعرض للملوثات البيئية

إن التعرض للعوامل البشرية له تأثير متعدد الأوجه على جسم الإنسان والحيوان. نظرًا لتأثيرها المعقد، يعد اكتشاف الآثار السلبية لعوامل معينة مهمة معقدة إلى حد ما. تم تطبيق المنهجية الأيضية التي تسمح بالتغلب على هذه الصعوبات في تقييم طبيعة ودرجة تأثير مخلفات إنتاج أسمدة البوتاس على مستويات الدهون في حيوانات التجارب بعد التلقيح داخل الأنف بمخلفات إنتاج الأسمدة البوتاسية واستهلاك مياه الشرب المتحصل عليها من المصادر. تقع في منطقة العمل المحتمل لإنتاج الأسمدة البوتاسية. تم إجراء عزل الدهون من المصل بمساعدة تقنية مطورة خصيصًا تعتمد على استخلاص العينات في الطور الصلب مما يسمح بإزالة الكولسترين من العينات. تم إخضاع كل عينة لتحليل HPLC-MS، وبعد ذلك تمت معالجة المخططات اللونية التي تم الحصول عليها باستخدام طريقة تحليل المكون الرئيسي والتحليل العنقودي. تسمح التقنية المطورة بفصل المستقلبات الكارهة للماء بكفاءة في مصل الدم. كان هناك ملف تعريف ثابت للدهون في مصل الدم لدى حيوانات التجارب، ولا سيما محتوى الدهون الفوسفاتية والأوكسيستيرويدات، وكانت هناك اختلافات في العمليات الأيضية لحيوانات الاختبار والتحكم. لقد تبين أنه في مصل حيوانات التجارب لوحظ زيادة في تركيز الهيدروكسيستيرويد مقارنة بالمجموعة الضابطة.

نص العمل العلمي حول موضوع "طريقة HPLC-MS لتحليل ملامح الدهون في مصل دم خنزير غينيا لتحديد التغيرات المبكرة في عملية التمثيل الغذائي عند التعرض للملوثات البيئية"

[الضبع والإصحاح 3/2014

تشاخوفسكي P.A.1، يانتسيفيتش A.V.2، دميتروشينكو A.E.2، إيفانشيك A.V.2

تقنية HPLC-MS-TECHNIQUE لتحليل مستويات الدهون في الدم

خنازير غينيا لاكتشاف التغيرات الأيضية المبكرة عند تعرضها للملوثات البيئية

TU "المركز العلمي والعملي الجمهوري للنظافة"، 220012، مينسك، جمهورية بيلاروسيا؛ ^ معهد الكيمياء العضوية الحيوية التابع للأكاديمية الوطنية للعلوم في بيلاروسيا، 220141، مينسك، جمهورية بيلاروسيا

تأثير العوامل البشرية له تأثير متعدد الأوجه على جسم الإنسان والحيوان. ونظرا لتأثيرها المعقد، فإن تحديد الآثار السلبية للعوامل الفردية يعد مهمة صعبة إلى حد ما. تم استخدام منهجية التمثيل الغذائي، التي تتيح التغلب على هذه الصعوبات، لتقييم طبيعة ودرجة تأثير النفايات الناتجة عن إنتاج أسمدة البوتاس على الملامح الدهنية لحيوانات التجارب أثناء التلقيح داخل الأنف بالنفايات الناتجة عن إنتاج أسمدة البوتاس واستهلاكها. مياه الشرب التي يتم الحصول عليها من مصادر تقع في منطقة العمل المحتمل لإنتاج البوتاس. تم إجراء فصل الدهون من المصل باستخدام تقنية مطورة خصيصًا تعتمد على استخلاص الطور الصلب، مما يجعل من الممكن إزالة الكوليسترول من العينات. تم تحليل كل عينة بواسطة تحليل كروماتوجرافي سائل عالي الأداء مع الكشف عن قياس الطيف الكتلي (HPLC-MS)، وبعد ذلك تمت معالجة المخططات اللونية الناتجة باستخدام تحليل المكون الرئيسي (PCA) والتحليل العنقودي. تتيح التقنية المطورة فصل المستقلبات الكارهة للماء بشكل فعال في مصل الدم. تم تحديد صورة الدهون في مصل الدم لدى حيوانات التجارب، وخاصة محتوى الدهون الفوسفاتية والأوكسيستيرويدات، كما تم العثور على اختلافات في عمليات التمثيل الغذائي بين حيوانات التجارب وحيوانات المراقبة. في مصل دم حيوانات التجارب، زاد تركيز الأوكسيستيرويدات مقارنة بالمجموعة الضابطة.

الكلمات المفتاحية: المنشطات. الدهون. مصل الدم؛ الملف الأيضي مخلفات صناعية.

P. A. Chakhovskiy1، A.V Yantsevich2، A. E. Dmitrochenko2، A. V. Ivanchik2 - تحليل ملامح الدهون في الدم في خنازير غينيا للكشف المبكر عن التغيرات في عملية التمثيل الغذائي تحت التعرض للملوثات البيئية

1المركز الجمهوري العلمي والعملي للنظافة، مينسك، جمهورية بيلاروسيا، 220012؛ 2معهد الكيمياء العضوية الحيوية، مينسك، جمهورية بيلاروسيا، 220141

للمراسلات: تشاخوفسكي بافيل أناتوليفيتش، chahovsky@gmail. com

إن التعرض للعوامل البشرية له تأثير متعدد الأوجه على جسم الإنسان والحيوان. نظرًا لتأثيرها المعقد، يعد اكتشاف الآثار السلبية لعوامل معينة مهمة معقدة إلى حد ما. تم تطبيق المنهجية الأيضية التي تسمح بالتغلب على هذه الصعوبات في تقييم طبيعة ودرجة تأثير مخلفات إنتاج أسمدة البوتاس على مستويات الدهون في حيوانات التجارب بعد التلقيح داخل الأنف بمخلفات إنتاج الأسمدة البوتاسية واستهلاك مياه الشرب المتحصل عليها من المصادر. تقع في منطقة العمل المحتمل لإنتاج الأسمدة البوتاسيوم. تم إجراء عزل الدهون من المصل بمساعدة تقنية مطورة خصيصًا تعتمد على استخلاص العينات في الطور الصلب مما يسمح بإزالة الكولسترين من العينات. تم إخضاع كل عينة لتحليل HPLC-MS، وبعد ذلك تمت معالجة المخططات اللونية التي تم الحصول عليها باستخدام طريقة تحليل المكون الرئيسي والتحليل العنقودي. تسمح التقنية المطورة بفصل المستقلبات الكارهة للماء بكفاءة في مصل الدم. كان هناك ملف تعريف ثابت للدهون في مصل الدم لدى حيوانات التجارب، ولا سيما محتوى الدهون الفوسفاتية والأوكسيستيرويدات، وكانت هناك اختلافات في العمليات الأيضية لحيوانات الاختبار والتحكم. لقد تبين أنه في مصل حيوانات التجارب لوحظ زيادة في تركيز الهيدروكسيستيرويد مقارنة بالمجموعة الضابطة.

الكلمات المفتاحية: الستيرويدات، الدهون، مصل الدم، الصورة الأيضية، النفايات الصناعية.

مقدمة

واحدة من أهم مهام بيولوجيا الأنظمة وعلم الوراثة الوظيفية هي تكامل البروتينات والنسخ والمعلومات حول عمليات التمثيل الغذائي التي تحدث في الجسم. ينعكس أي مرض أو عملية مرضية تحدث في الجسم على محتوى المستقلبات ذات الوزن الجزيئي المنخفض في الأنسجة والدم. بالنسبة للخصائص المتكاملة للأيضات ذات الوزن الجزيئي المنخفض في بلازما الدم، تم تقديم مصطلح "المظهر الأيضي" في عام 1971. نظرًا لأن التحليل المتزامن لفئات متعددة من المستقلبات معقد للغاية وغير عملي، فإن سلسلة من التقنيات، بما في ذلك التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR)، تُستخدم عادةً لدراسة الملامح الأيضية دقة عاليةوالكروماتوغرافيا - قياس الطيف الكتلي.

كقاعدة عامة، عند إجراء الدراسات الأيضية، فهي تقتصر على مجموعة معينة من المواد التي يتم فصلها عن المكونات الأخرى أثناء تحضير العينة. بيانات المجموعة الناتجة أسهل في التفسير.

يمكن استخدام الملامح الأيضية (خاصة البول وبلازما الدم) لتحديد طبيعة التغيرات الفسيولوجية الناجمة عن تناول المركبات السامة. في كثير من الحالات، يمكن أن توفر التغييرات الملحوظة توصيفًا إضافيًا لآفات معينة، مثل الكبد والأنسجة الدهنية.

إن تحليل المنشطات والدهون في مصل الدم له إمكانات تشخيصية كبيرة. إن التركيب الدهني لمصل الدم وهرمونات الستيرويد وسلائفها ومنتجات تحولاتها الأيضية يميز العديد من المعلمات الوظيفية للجسم. تلعب هذه المواد دورًا تنسيقيًا مهمًا في تنظيم عملية التمثيل الغذائي ووظيفة القلب والأوعية الدموية وتشارك في استجابة الجسم للإجهاد الحاد والمزمن.

يعد ملف الستيرويد معيارًا تشخيصيًا فريدًا لعدد من أمراض النساء والأورام المرتبطة بضعف تخليق واستقلاب هرمونات الستيرويد، في حين لا يمكن تشخيص بعضها إلا من خلال ملف الستيرويد. في تحليل الملف الشخصي، إمكانية استخدام القيم المطلقةكمتغيرات بسيطة ومقارنتها مع القاعدة. ومع ذلك، قد يكون تغيير نسبة الكميات أكثر أهمية. بالإضافة إلى ذلك، يوفر ملف تعريف الستيرويد معلومات حول عدد كبير من المنشطات في نفس الوقت.

يعد تحديد ملف الستيرويد في المصل طريقة فعالة لتحديد جميع اضطرابات استقلاب الستيرويد تقريبًا، مما يجعل من الممكن تشخيصها

التشخيص الدقيق في العديد من الحالات السريرية، على سبيل المثال، مع تضخم الغدة الكظرية الخلقي، فرط ألدوستيرونية من النوع الأول، فرط ألدوستيرونية أولي، مرض إتسينكو كوشينغ، قصور الغدة الكظرية، وما إلى ذلك. يعد ملف الستيرويد مهمًا في تشخيص اضطرابات التمايز الجنسي ووظيفة الغدد التناسلية، كما وكذلك قصور الغدة النخامية والكظرية.

يؤدي الإفراط في تناول الملح، وهو المكون السائد في نفايات سماد البوتاسيوم، إلى جسم فئران التجارب ذات الوزن الزائد إلى تنشيط مفرط لتخليق الألدوستيرون ويسبب ارتفاع ضغط الدم وتلف الكلى مع متلازمة التمثيل الغذائي.

في مناطق الإنتاج الصناعي مع درجة عاليةالتلوث البيئي، فإن معدل الإصابة بالمرض بين السكان عادة ما يكون أعلى منه في المناطق "النظيفة" نسبيا. كان الهدف من بحثنا هو مدينة سوليجورسك، الواقعة في منطقة التعدين على نطاق واسع ومعالجة خامات البوتاس. وفي مناطق مقالب الملح ومرافق تخزين الحمأة لمصانع البوتاس، تشكلت منطقة ملوحة كلوريد الصوديوم، والتي تغطي المياه الجوفية إلى عمق أكثر من 100 متر، مما يمكن أن يؤثر على تلوث مصادر إمدادات مياه الشرب والهواء الجوي .

لتقييم تأثير تلوث المكونات البيئية الفردية في منطقة الإنتاج الصناعي لأسمدة البوتاس، قمنا بتحليل مستويات الدهون في مصل الدم كمؤشر على الاضطرابات الأيضية المبكرة تحت تأثير خليط من المواد الكيميائية.

الغرض من العمل هو تحديد التغيرات الأيضية في حيوانات المختبر مع التعرض للنفايات الناتجة عن إنتاج أسمدة البوتاسيوم واستهلاك مياه الشرب التي تم الحصول عليها من مصادر يحتمل أن تتأثر بنفايات الإنتاج، وذلك باستخدام طريقة التحليل الكروماتوغرافي السائل عالي الأداء مع الكشف الطيفي الكتلي. ([هبلك-مس).

كان الهدف من الدراسة هو مصل الدم لحيوانات التجارب (الخنازير الغينية) للمجموعتين التجريبية والضابطة.

المواد والأساليب

دراسات تجريبيةأجريت على 35 خنزير غينيا (17 أنثى و 18 ذكر) بوزن 305-347 جرام.

[الضبع والإصحاح 3/2014

المجموعة التجريبية (التحضير بالنفايات الناتجة عن الإنتاج الصناعي لأسمدة البوتاس ومياه الشرب من نظام إمدادات المياه في سوليجورسك)، 20 فردًا (10 إناث و10 ذكور)؛

مجموعة المراقبة (التحضير بمحلول كلوريد الصوديوم متساوي التوتر لاستبعاد تأثيرات عامل الإجهاد الناتج عن إجراء التحضير)، 15 فردًا (8 ذكور و7 إناث).

خلال التجربة تم مراقبة الحالة العامة للحيوانات واستهلاك الغذاء والماء يوميا.

لنمذجة التعرض المزمن عن طريق الاستنشاق (12 أسبوعًا) للنفايات الناتجة عن إنتاج أسمدة البوتاسيوم، تم الاسترشاد بـ MU.No.11-11-10-2002 "متطلبات إجراء دراسات السمية والحساسية أثناء التنظيم الصحي للهباء الجوي المحتوي على البروتين في هواء منطقة العمل"، بما في ذلك تحديد الجرعة الأولية. تم طحن عينات من مقالب الملح في ملاط ​​رخامي إلى حالة غبار متجانسة، وتم إذابتها في الماء المقطر إلى التركيز المطلوب، مع مراعاة وزن جسم حيوانات التجارب (تمت مراقبة وزن الجسم أسبوعيًا لضبط الجرعة). كانت الجرعات المحسوبة: في بداية التجربة - 2.028 مجم / 0.1 سم 3، بعد 4 أسابيع - 2.85 مجم / 0.1 سم 3، بعد 6 أسابيع - 3.17 مجم / 0.1 سم 3، بعد 8 أسابيع وحتى نهاية التجربة 3.8 مجم / 0.1 سم3.

تم تثبيت خنزير غينيا بدون تخدير في وضعية الاستلقاء مع رفع رأسه، وتم حقن جرعة من المحلول الدافئ بالتناوب في فتحتي الأنف (جزئيًا) باستخدام موزع ماصة (أكثر من 2-3 دقائق) بطريقة تمنع العطس. . وأكدت أصوات "السحق" الناتجة اختراق المحلول في الجهاز التنفسي.

قامت مجموعة حيوانات التجربة "باستنشاق" الخليط مرة واحدة يومياً، 5 أيام في الأسبوع، لمدة 12 أسبوعاً. الحيوانات في المجموعة الضابطة "استنشاق" المحلول الملحي (0.9% كلوريد الصوديوم).

للاختيار مادة بيولوجيةتم تخدير الحيوانات (تخدير الأثير)، وتم جمع الدم بعد قطع الرأس. تم الحصول على المصل عن طريق الطرد المركزي عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة وتخزينه عند -20 درجة مئوية لمزيد من الدراسات. تم تحليل الدهون الفوسفاتية والأوكسيستيرويدات والأحماض الدهنية في مصل الدم.

إعداد عينة. تمت إضافة معيار داخلي، البروجسترون، إلى مصل الدم لتحقيق تركيز 10-5 م (10 ميكرولتر لكل 1 مل من العينة). بعد ذلك، لترسيب البروتينات الموجودة في العينة واستخلاص الستيرويدات، تمت إضافة الميثانول إلى تركيز نهائي قدره 70٪ (2.33 مل من الميثانول لكل 1 مل من العينة)، يليه الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 10000 جم. شكلت البروتينات الموجودة في العينة رواسب كثيفة. تم فصل المادة الطافية عن الراسب وتمريرها عبر عمود استخلاص الطور الصلب المشروط مسبقًا (SPE) الذي يحتوي على 100 مجم من هلام السيليكا أوكتاديسيليل. تم تكييف عمود SPE بتمرير 2 مل من الميثانول و 2 مل من الماء و 2 مل من 70٪ ميثانول على التوالي. في المرحلة الأولى، يرتبط الكوليسترول بالعمود، حيث يكون محتواه في بلازما الدم والسوائل البيولوجية الأخرى مرتفعًا جدًا، بالإضافة إلى عدد من الدهون الأخرى شديدة الكارهة للماء. بعد ربط الكولسترول، تم غسل العمود أيضًا باستخدام 2 مل من 70% ميثانول. إذا كان هناك نسبة عالية من الكولسترول في العينة أو حجم عينة كبير، استخدم

استخدمنا عمود SPE بمحتوى عالي من المواد الماصة. تم الجمع بين الشطف وتبخرت. تم إجراء التبخر عند 50 درجة مئوية في تيار من الغاز الخامل. تم إذابة البقايا الجافة في 500 ميكرولتر من الميثانول وطردها لمدة 10 دقائق عند 10000 جم. في هذه الحالة، تترسب المركبات القطبية غير القابلة للذوبان في الميثانول. تم فصل المادة الطافية عن الرواسب وتخفيفها بالماء إلى تركيز ميثانول قدره 10%. تم تمرير المحلول الناتج من خلال عمود SPE مكيف مسبقًا (تم تمرير 2 مل من الميثانول، 2 مل من الماء و 2 مل من 10٪ ميثانول) وتم غسله باستخدام 2 مل من 10٪ ميثانول. تم شطف المنشطات المرتبطة بالعمود بـ 3 مل من 80٪ ميثانول. تم تبخير المحلول وتم إذابة البقايا الجافة في 100 ميكرولتر من الميثانول. تم تحليل الحل الناتج باستخدام HPLC-MS.

تحليل HPLC. تم إجراء التحليل على كروماتوجرافيا Accela المجهز بكاشف قياس الطيف الكتلي LCQ-Fleet. تم إجراء الفصل على عمود Cosmosil 5C18-MS-II بمعلمات هندسية 4.6*150 مم (Nacalai Tesque، اليابان).

برنامج الفصل (المذيب أ - الماء، المذيب ب - الميثانول، معدل التدفق 500 ميكرولتر / دقيقة): لمدة 5 دقائق 60٪ ب، 12 دقيقة - التدرج الخطي 60-95٪ ب، 10 دقيقة - 95٪ ب، 8 دقيقة - خطي التدرج 95-100% ب، 5 دقائق - 100% ب، 5 دقائق - 60% ب.

لتحليل الطيف الكتلي، تم استخدام مصدر التأين الكيميائي في الضغط الجوي(أبسي). معلمات مصدر التأين: درجة حرارة المبخر - 350 درجة مئوية، تدفق غاز التجفيف - 35 وحدة، تدفق الغاز المساعد - 5 وحدات، درجة حرارة الشعيرات الدموية - 275 درجة مئوية، الجهد الشعري - 18 فولت، جهد العدسة الأيونية - 80 فولت. المسح الضوئي المعتمد على البيانات المستخدمة وضع استخدام مصيدة أيون في نطاق المسح 50-1000 م/ض.

تم تحويل المخططات اللونية التي تم الحصول عليها باستخدام كاشف قياس الطيف الكتلي في وضع التأين الكيميائي (تيار الأيون الإجمالي) إلى تنسيق نصي باستخدام برنامج Qual Browser من حزمة Xcalibur (Thermo Sci، الولايات المتحدة الأمريكية). تمت معالجة المعلومات التي تم الحصول عليها باستخدام طريقة المكون الرئيسي المطبقة في حزمة Statistica 10 وأدوات التحليل العنقودي وبناء مخطط الأشجار. تم استخدام الكتاب المرجعي لتفسير أطياف الكتلة وتحديد المركبات الفردية.

النتائج والمناقشة

كانت الطريقة الأولية للتكيف هي طريقة استخلاص الطور الصلب للستيرويدات من المصل وبلازما الدم، الموصوفة في دليل استخلاص الطور الصلب من Macherey-Nagel. دليل التطبيق، الذي يقدم توصيات لاستخدام أعمدة استخراج الطور الصلب. أتاحت تقنية تحضير العينة المعدلة مع استخلاص الطور الصلب عزل الدهون الفوسفاتية والأوكسيستيرويدات والأحماض الدهنية بشكل فعال من مصل الدم للخنازير الغينية.

تتيح تقنية الفصل الكروماتوغرافي الموصوفة إمكانية الفصل الفعال لكل من هرمونات الستيرويد والدهون الموجودة في المصل.

تم تحليل العينات وفقا للطرق الموصوفة. في التين. 1 (انظر الصفحة 2 من الغلاف) يظهر، على سبيل المثال، مخططات كروماتوغرافية متراكبة تم الحصول عليها من تحليل 3 عينات من المجموعة التجريبية (مظللة

أرز. 4. أطياف الكتلة للمادة مع زمن الاحتفاظ 21.5 دقيقة: أ - التأين الكيميائي عند الضغط الجوي في الوضع السلبي؛ ب - التأين الكيميائي عند الضغط الجوي في الوضع الإيجابي.

باللون الأحمر) و3 عينات من المجموعة الضابطة (باللون الأزرق). ولوحظت صورة مماثلة في حالات أخرى.

لمعالجة مجموعات البيانات هذه، استخدمنا طريقة المكون الرئيسي (PCA) والتحليل العنقودي، مما جعل من الممكن تحديد الاختلافات في ملفات تعريف الدهون بين المجموعتين الضابطة والتجريبية. تم الحصول على مؤامرة PCA للمكونات الرئيسية الأولى والثانية

عند تقليل بُعد البيانات، كما هو موضح في الشكل. 2 (انظر صفحة الغلاف الثانية). من السهل ملاحظة على الرسم البياني أن النقاط مجمعة في مجموعتين، متوضعتين في الأرباع 1 و4 و2 و3 على التوالي. في هذه الحالة، تقع النقاط المقابلة للنماذج الأولية في الغالب في الربعين الأول والرابع، ويتم تحديد النقاط المقابلة لعينات التحكم في الربعين الثاني والثالث. dendrogram التي تم الحصول عليها عن طريق وضع

[الضبع والإصحاح 3/2014

تحديد القمم الموجودة في اللوني

وقت الاحتفاظ، الحد الأدنى القمم الرئيسية في وضع "+" القمم الرئيسية في وضع "-".

19,15 393,7 446,8

448,7 493,5 623,4 524,4

19,35 87 227 271 335,5 353,3 371,2 389.1 448.2 493.3 405,4

21,50 316,1 390,0

430.3 448.4 779,1

23,8 319.4 391,6 429.5 783,2

24,35 414,8 448,8

31,73 313,3 330,9

33,9 231.5 245.5 263,3 281,1 295.1 305.2 371.3 521.0 663.1 279,4

مادة

فوسفاتيديل كولين

حمض الأراكيديك

حمض الفوسفاتيديك 42:4

أحماض الأراكيديك والدوكوسات تراينويك

دوكوسابنتاينويك

حمض اللينوليك

ثنائي هيدروكسي كوليستيرول

تحليل القص، كما هو موضح في الشكل. 3. وهكذا يشير التحليل الإحصائي للبيانات الكروماتوغرافية إلى وجود اختلافات في العمليات الأيضية التي تحدث في كائنات حيوانات التجارب التابعة للمجموعتين الضابطة والتجريبية.

لتحديد التغيرات الأيضية المحددة، تم فك رموز أطياف الكتلة وتحديدها.

يتم تحديد الاتصالات الفردية (انظر الجدول). كان حجم العينة غير كاف للتحليل ولم يسمح لنا باكتشاف التغيرات في صورة هرمون الستيرويد في المصل. ومع ذلك، تم الكشف عن الدهون ذات القطبية المتوسطة في اللوني.

تم التعرف على المركبات الفردية من خلال تحليل أطياف الكتلة للمواد المسجلة تحت أوضاع التأين المختلفة. وبالتالي، يظهر في الشكل 1 طيف الكتلة للمادة في وضعين للتأين مع زمن استبقاء قدره 21.5 دقيقة. 4. أظهر تحليل هذا الطيف أن المادة عبارة عن ثنائي أسيل-سن-جليسيروفوسفات مع الوزن الجزيئي الغرامي 780 (R1(311) = 20:0 حمض دهني (حمض الأراكيديك)، R2(331) = 22:4 حمض دهني (حمض دوكوساتيتراينويك)).

لقد وجد أن الذروة الكروماتوغرافية مع زمن احتفاظ قدره 42.52 دقيقة تتوافق مع ثنائي هيدروكسي كوليستيرول، والذي يُفترض أنه أحد السلائف في التخليق الحيوي للأحماض الصفراوية. تشير الاختلافات في محتوى الأوكسيستيرويدات في مصل الدم إلى احتمال وجود اضطراب في استقلاب الأحماض الصفراوية. تجدر الإشارة إلى أنه في الكروماتوجرام الموضح في الشكل. كما هو مبين في الشكل 1، يوجد في مصل دم حيوانات التجارب زيادة في تركيز الأوكسيستيرويدات مقارنة بالتحكم (يبلغ الذروة مع فترة احتفاظ تبلغ 35-45 دقيقة).

خاتمة. تتيح التقنية المستخدمة في العمل الكشف المبكر عن الاضطرابات في استقلاب الدهون عند التعرض للملوثات البيئية بدرجة عالية من الكفاءة. تشير النتائج التي تم الحصول عليها إلى أن إعطاء المحاليل المائية لمقالب الملح عن طريق الأنف لحيوانات Cavia porcellus التجريبية يؤدي إلى تغيرات في استقلاب الدهون والأوكسيستيرويدات. على وجه الخصوص، قد تترافق المستويات المتزايدة الملحوظة من سلائف حمض الصفراء (هيدروكسيستيرويدات) في الحيوانات مع خلل في الكبد والإنزيمات المشاركة في التخليق الحيوي للأحماض الصفراوية. وبالتالي، يمكن استخدام النهج الموصوف لتحديد اضطرابات استقلاب الدهون لدى سكان المناطق ذات التلوث التكنولوجي.

الأدب

1. هورنينغ إي سي، هورنينغ إم جي الملامح الأيضية: طرق المرحلة الغازية لتحليل المستقلبات. كلين. الكيمياء. 1971؛ 17(8): 802-9.

2. Constantinou M.A.، Tsantili-Kakoulidou A.، Andreadou I.، Iliodro-mitis E.K.، Kremastinos D.T.، Mikros E. تطبيق علم الأيض القائم على الرنين المغناطيسي النووي في التحقيق في نقص تروية عضلة القلب - ضخه، والشروط المسبقة الإقفارية والتدخل المضاد للأكسدة في الأرانب. يورو. جي فارم. الخيال العلمي. 2007; 30(3-4): 303-14.

3. لو دبليو، بينيت بي دي، رابينوفيتش جيه دي الاستراتيجيات التحليلية لعمليات التمثيل الغذائي المستهدفة المستندة إلى LC-MS. J. كروماتوجر. ب.تحليل. تكنول. بيوميد. علوم الحياة. 2008; 871(2): 236-42.

4. Novotny M.V.، Soini H.A.، Mechref Y. الفردية الكيميائية الحيوية تنعكس في الملامح الكروماتوغرافية والكهربية والطيف الكتلي. J. كروماتوجر. ب.تحليل. تكنول. بيوميد. علوم الحياة. 2008; 866(1-2): 26-47.

5. جيرمان جيه بي، جيليس إل إيه، سميلوويتز جيه تي، زيفكوفيتش إيه إم، واتكينز إس إم الدهون والتنميط الدهون في التمثيل الغذائي. العملة. رأي. ليبيدول. 2007; 18(1): 66-71.

6. شوارتز إي، ليو إيه، راندال إتش، هاسليب سي، كيون إف، موراي إم وآخرون. استخدام التنميط الستيرويدي بواسطة UPLC-MS/MS كاختبار من المستوى الثاني في فحص حديثي الولادة لتضخم الغدة الكظرية الخلقي: تجربة يوتا. طب الأطفال. الدقة. 2009؛ 66(2): 230-5.

7. قياس Rauh M. الستيرويد بـ LC-MS/MS. طلب

إلى الفن. تشاخوفسكي وآخرون.

أرز. 3. تم إنشاء مخطط Dendrogram على أساس التحليل العنقودي ويوضح تجميع العينات في مجموعات.

إلى الفن. تشاخوفسكي وآخرون.

أرز. 1. اللوني المشترك للعينات 1-3 من المجموعة الضابطة (مظللة باللون الأحمر) و15-17 من المجموعة التجريبية (مظللة باللون الأزرق).

إسقاط الحالات على مستوى العامل (1 × 2) الحالات بمجموع مربع جيب التمام >= 0.00

١٨/٣ ٩/ض ٢١/١ ■ O

1 قرض "ش س 28/1" 22/10 41/1 ص

العامل 1: 65.71%

أرز. 2. الرسم البياني الذي تم الحصول عليه عن طريق معالجة اللوني باستخدام PCA. يتم تمييز المجموعة الضابطة باللون الأزرق، والمجموعة التجريبية باللون الأحمر.

لقد زاد استخدام التحليل اللوني السائل عالي الأداء إلى جانب قياس الطيف الكتلي الترادفي (HPLC-MS/MS) في المختبرات السريرية بشكل كبير خلال السنوات العشر إلى الـ 12 الماضية، وفقًا لمراجعة نُشرت في مجلة Clinical Biochemist Review. لاحظ المؤلفون أن خصوصية تحليل HPLC-MS/MS تتفوق بشكل كبير على الطرق المناعية والكروماتوغرافيا السائلة الكلاسيكية عالية الأداء (HPLC) لتحليل الجزيئات ذات الوزن الجزيئي المنخفض ولها إنتاجية أعلى بكثير من التحليل اللوني للغاز ومطياف الكتلة (GC). -آنسة). يتم حاليًا تفسير شعبية هذه الطريقة في التحليلات السريرية الروتينية من خلال القدرات الفريدة لهذه الطريقة.

المزايا الرئيسية لطريقة HPLC-MS/MS هي:
• إمكانية التحليل الكمي الدقيق للجزيئات الصغيرة.
• التحليل المتزامن للمركبات المستهدفة المتعددة؛
• خصوصية فريدة
• سرعة عالية في التحليل.

في السنوات الاخيرةيتم إيلاء الكثير من الاهتمام لوقت التحليل، ونتيجة لذلك، لزيادة إنتاجية المختبر. أصبحت التخفيضات الكبيرة في وقت التحليل ممكنة من خلال استخدام أعمدة تحليلية قصيرة لـ HPLC/MS/MS، مع زيادة خصوصية التحليل بشكل كبير. إن استخدام تأين الضغط الجوي (API)، ومطياف الكتلة الرباعي الثلاثي الترادفي، والكروماتوغرافيا السائلة المتقدمة عالية الأداء، بالإضافة إلى تقنيات إعداد العينات المرتبطة بها، قد جعل HPLC-MS/MS في طليعة الأساليب التحليلية الحديثة للبحث السريري.

المجالات الرئيسية لتطبيق HPLC/MS/MS في الطب السريري:
• الحصول على صورة استقلابية كاملة للوحات الستيرويدات والبيورينات والبيريميدينات والمركبات الأخرى،
  فحص الأطفال حديثي الولادة بحثًا عن الأخطاء الأيضية الخلقية (الكشف عن عشرات الأمراض في اختبار واحد)؛
• المراقبة العلاجية للأدوية - مثبطات المناعة، ومضادات الاختلاج، ومضادات الفيروسات القهقرية، ومضادات التخثر، وأي أدوية أخرى - بغض النظر عن توفر مجموعات الشركة المصنعة. ليست هناك حاجة لشراء مجموعات باهظة الثمن لكل مادة - يمكنك تطوير أساليبك الخاصة؛
• علم السموم السريري – تحليل أكثر من 500 مركب مخدر ومستقلباتها في تحليل واحد، بدون تحليل مؤكد
  البروتينات والأيض.

بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام HPLC-MSMS لفحص السكريات البولية، والكبريتات، والسكريات طويلة السلسلة. الأحماض الدهنية، الأحماض الصفراوية طويلة السلسلة، حمض الميثيل مالونيك، أبحاث حول البورفيريا، فحص المرضى الذين يعانون من اضطرابات استقلاب البيورين والبيريميدين.

أمثلة تطبيقية على اللوني السائل
بالاشتراك مع قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب في التحليلات السريرية.

فحص حديثي الولادة:كان المثال الأول للاستخدام الواسع النطاق لـ HPLC-MS/MS في التشخيص السريري هو فحص الأخطاء الخلقية في التمثيل الغذائي عند الأطفال حديثي الولادة. حاليًا، في البلدان المتقدمة، تعد هذه طريقة روتينية وتغطي أكثر من 30 مرضًا مختلفًا، بما في ذلك تسمم الدم، واعتلال الأحماض الأمينية، وعيوب أكسدة الأحماض الدهنية. وتجدر الإشارة بشكل خاص إلى دراسات العيوب الخلقية التي يمكن أن تؤدي إلى مشاكل خطيرة إذا لم تتم معالجتها على الفور (على سبيل المثال، تضخم القلب أو الكبد أو تورم الدماغ). تتمثل ميزة استخدام HPLC-MS/MS لفحص الأطفال حديثي الولادة في القدرة على تحليل جميع الأحماض الأمينية والأسيل كارنيتينات في وقت واحد بطريقة سريعة وغير مكلفة ومحددة للغاية.

رصد المخدرات العلاجية:كان تطوير وإدخال عقار سيروليموس (راباميسين) المثبط للمناعة لمنع رفض الأعضاء بعد زرع الأعضاء أحد الدوافع الرئيسية لإدخال HPLC-MS/MS في المختبرات السريرية. الطريقة الحديثةيتيح HPLC-MS/MS التحديد المتزامن للتاكروليموس، والسيروليموس، والسيكلوسبورين، والإيفروليموس، وحمض الميكوفينويك.

يستخدم HPLC-MS/MS أيضًا لتحليل الأدوية السامة للخلايا والمضادة للفيروسات القهقرية ومضادات الاكتئاب ثلاثية الحلقات ومضادات الاختلاج والأدوية الأخرى التي تتطلب جرعات فردية.

تسمح طريقة HPLC-MSMS بالفصل والتقدير الكمي للمضادات الضوئية R- وS للوارفارين في نطاق تركيز يتراوح بين 0.1-500 نانوغرام/مل.

المخدرات ومسكنات الألم:يستخدم HPLC-MS/MS على نطاق واسع لتحليل هذه المركبات بسبب سهولة إعداد العينة وقصر وقت التحليل. تُستخدم هذه الطريقة حاليًا في المختبرات السريرية لفحص وجود مجموعة واسعة من الأدوية. إن الخصوصية والحساسية الفريدة لهذه الطريقة تجعل من الممكن تحليل أكثر من 500 مركب من فئات مختلفة في عينة واحدة في وقت واحد مع الحد الأدنى من تحضير العينة. لذا، في حالة تحليل البول، يكون التخفيف البسيط للعينة بمقدار 50-100 مرة كافيًا. عند تحليل الشعر، بدلاً من مجموعة من 100 إلى 200 شعرة، تكفي شعرة واحدة لتحديد حقائق تعاطي المخدرات بشكل موثوق.

تحليل الغدد الصماء والستيرويد:يستخدم HPLC-MS/MS على نطاق واسع في العديد من مختبرات الغدد الصماء لتحليل المنشطات - التستوستيرون، الكورتيزول، الألدوستيرون، البروجسترون، الإستريول وغيرها الكثير.

بدأت المزيد والمزيد من المختبرات في استخدام HPLC-MS/MS لتحديد مستويات فيتامين D3 وD2 في الدم.

I. تحديد المنشطات (ملف الستيرويد).

تتمتع مختبرات المستشفيات والعيادات الآن بالقدرة على إجراء التحديد المتزامن للستيرويدات المتعددة باستخدام HPLC/MS/MS. في هذه الحالة، ليست هناك حاجة لحجم عينة كبير، وهو أمر مهم بشكل خاص عند تحليل عينات الأطفال.

الحالات التي يُنصح فيها بتحديد العديد من المنشطات (التنميط):
• تضخم الغدة الكظرية الخلقي (CAH) هو عيب خلقي في التخليق الحيوي للستيرويد. هذه مجموعة وراثية من الأمراض الناجمة عن النشاط غير السليم للإنزيمات في قشرة الغدة الكظرية، مما يؤدي إلى انخفاض إنتاج الكورتيزول. للحصول على تشخيص موثوق لـ NAS، يوصى بقياس الكورتيزول والأندروستينيديون و17-هيدروكسي بروجستيرون. يتيح HPLC/MS/MS تقديرًا دقيقًا لجميع المنشطات الثلاثة في تحليل واحد بثقة 100%.
• يتميز الفحص الروتيني لحديثي الولادة باستخدام المقايسات المناعية بمعدل مرتفع من النتائج الإيجابية والسلبية الكاذبة. تحديد HPLC/MS/MS ليس فقط للكورتيزول، ولكن أيضًا للألدوستيرون و11-ديوكسيكورتيزول يجعل من الممكن التمييز بين قصور الغدة الكظرية الأولي والثانوي.
• HPLC/MS/MS يسمح بتحديد المنشطات في التهاب البروستاتا ومتلازمة آلام الحوض المزمنة.
• يمكن لـ HPLC-MS/MS تحديد ملامح الستيرويد وتحديد أسباب البلوغ المبكر المرتبط بقشرة الكظر لدى الأطفال الصغار. وقد وجد أن تركيزات هرمون التستوستيرون والأندروستينيديون وديهيدروإيبي أندروستيرون (DHEA) وكبريتاته لدى هؤلاء الأطفال كانت أعلى قليلاً منها لدى الأطفال الأكبر سناً.
• يتم تحليل مصل الدم لدى المدخنين النشطين والمدخنين السلبيين وغير المدخنين لوجود 15 هرمونًا ستيرويديًا وهرمونات الغدة الدرقية للتحقق من العلاقة بين تعرض المريض للدخان وتركيز الهرمونات.
• يستخدم HPLC/MS/MS في تحديد ملامح بعض الهرمونات الستيرويدية الأنثوية في البول.
• تم استخدام HPLC/MS/MS لتقييم تركيزات الهرمونات العصبية للوقاية من الاعتلال العصبي السكري.

ثانيا. تحديد هرمونات الغدة الدرقية

تعتمد الطرق الروتينية لتحديد هرمونات الغدة الدرقية عادةً على المقايسة المناعية الإشعاعية، وهي باهظة الثمن ولا تكتشف سوى T3 وT4، مما قد يحد من القدرة على تحديد وظيفة الغدة الدرقية وتنظيمها بالكامل.

• حاليًا، باستخدام HPLC-MSMS، يتم إجراء التحليل المتزامن لخمسة هرمونات الغدة الدرقية في عينات المصل، بما في ذلك هرمون الغدة الدرقية (T4)، 3،3′،5-ثلاثي يودوثيرونين (T3)، 3،3′،5′- (rT3) ، 3،3'-ثنائي يودوثيرونين (3،3'-T2) و 3،5-ثنائي يودوثيرونين (3،5-T2) في نطاق التركيز 1 -500 نانوغرام / مل.
• تُستخدم طريقة HPLC/MS/MS أيضًا لتحليل تركيبة الهرمونات لدى المرضى الذين خضعوا لاستئصال الغدة الدرقية. يتم تحديد مستويات تركيز هرمون الغدة الدرقية (T4) وثلاثي يودوثيرونين (T3) وT4 الحر وهرمون الغدة الدرقية (TSH) بعد الجراحة. تم العثور على HPLC/MS/MS كوسيلة ممتازة لتحديد العلاقة بين TSH وتركيزات هرمون الغدة الدرقية.
• تم استخدام طريقة HPLC/MS/MS لتحديد هرمون الغدة الدرقية (T4) في اللعاب والمصل البشري. وتتميز هذه الطريقة بقابلية التكرار العالية والدقة وحد الكشف البالغ 25 بيكوغرام/مل. أظهرت الدراسات أن هناك علاقة تشخيصية في تركيزات T4 اللعابية بين مرضى الغدة الدرقية والمرضى الذين يعانون من مرض جريفز.

تتمتع طريقة HPLC/MS/MS الآن بالحساسية والنوعية والدقة المطلوبة لتحديد موثوق لجميع المنشطات في السوائل البيولوجية وبالتالي تحسين القدرات التشخيصية، خاصة في حالة تحديد مجموعات المنشطات.

ثالثا. تقدير 25-هيدروكسي فيتامين د بواسطة HPLC/MS/MS

25-هيدروكسي فيتامين د (25OD) هو الشكل الرئيسي المنتشر لفيتامين د ومقدمة لشكله النشط. (1,25-ثنائي هيدروكسي فيتامين د). نظرًا لعمر النصف الطويل، فإن تحديد 25OD مهم لتحديد حالة فيتامين د في جسم المريض. يوجد فيتامين د في شكلين: فيتامين د3 (كوليكالسيفيرول) وفيتامين د2 (إرغوكالسيفيرول). يتم استقلاب كلا النموذجين إلى أشكال 25OD الخاصة بهما. من الأمور ذات الأهمية الكبيرة للتشخيص توافر الطرق التحليلية التي يمكنها تحديد كلا شكلي الفيتامين بدقة عالية وتسمح بمراقبة المرضى الذين يعانون من نقص فيتامين د. ولم تسمح الطرق المستخدمة حتى الآن بتحديد فيتامين د2 ود3 بشكل منفصل. بالإضافة إلى ذلك، عند التركيزات العالية من فيتامين د2، يتم التقليل من الكمية التي يمكن اكتشافها من فيتامين د3. عيب آخر هو استخدام النظائر المشعة. إن استخدام طريقة HPLC/MS/MS جعل من الممكن ليس فقط تجنب استخدام النظائر المشعة، ولكن أيضًا إجراء تحديد منفصل لكلا الشكلين النشطين من الفيتامين.

تنطبق الطريقة على المرضى التاليين:
1. إذا كنت تشك في انخفاض مستوى فيتامين د في الجسم؛
2. في حالة الاشتباه في سمية غير مفسرة؛
3. عند فحص المرضى الذين يخضعون للعلاج لمعرفة انخفاض مستويات فيتامين د؛
4. يسمح استخدام HPLC/MS/MS بتحديد كلا النموذجين بشكل منفصل عند مراقبة المرضى.

رابعا. تحديد مثبطات المناعة بواسطة HPLC/MS/MS

بعد زراعة الأعضاء، يجب تناول الأدوية المثبطة للمناعة مدى الحياة لتجنب الرفض. مع نطاق علاجي ضيق للغاية وسمية عالية، تتطلب مثبطات المناعة جرعات فردية لتحقيق أقصى قدر من التأثير. ولذلك، فإن مراقبة الأدوية المثبطة للمناعة الرئيسية: السيكلوسبورين A، والتاكروليموس، والسيروليموس، والإيفروليموس أمر حيوي لضبط جرعة الأدوية لكل مريض على حدة اعتمادًا على تركيز الدواء في الدم.

لا تزال المقايسات المناعية تستخدم لمراقبة هذه الأدوية، ولكن هذه الطرق باهظة الثمن ولها خصوصية ودقة وإمكانية تكرار نتائج محدودة. هناك حالات وفاة للمرضى بسبب جرعات غير صحيحة من مثبطات المناعة بناءً على النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام الطرق المناعية. حاليًا، يتم استبدال المقايسات المناعية في المختبرات السريرية بـ HPLC/MS/MS. وهكذا، في عيادة جامعة ميونيخ، يتم تحليل حوالي 70 عينة يوميًا لمحتوى السيروليموس والسيكلوسبورين A باستخدام نظام HPLC/MS/MS. يتم تنفيذ جميع عمليات إعداد العينات والتحكم في الأجهزة بواسطة موظف واحد. يتحول المختبر أيضًا إلى اختبار التاكروليموس باستخدام هذه الطريقة.

• تم وصف استخدام HPLC/MS/MS للتحديد المتزامن الروتيني للتاكروليموس، والسيروليموس، والأسكوميسين، والديميثيكسسيروليموس، والسيكلوسبورين A، والسيكلوسبورين G في الدم. النطاق الذي يحدده التركيز هو 1.0 - 80.0 نانوغرام / مل. للسيكلوسبورين 25 - 2000 نانوجرام/مل. وقام المختبر خلال العام بتحليل أكثر من 50 ألف عينة.
• وبما أن الاستخدام المتزامن للتاكروليموس والسيروليموس له تأثير علاجي إيجابي، فقد تم تطوير طريقة HPLC/MS/MS بسيطة وفعالة لتحديد كل منهما بشكل منفصل في الدم للتحليل السريري. يستغرق تحليل عينة واحدة 2.5 دقيقة بدقة تتراوح بين 2.46% - 7.04% للتاكروليموس و5.22% - 8.30% للسيروليموس للمنحنى التحليلي بأكمله. الحد الأدنى للكشف عن تاكروليموس هو 0.52 نانوغرام / مل، لسيروليموس - 0.47 نانوغرام / مل.

V. تحديد الهوموسيستين بواسطة HPLC/MS/MS

يثير الهوموسيستين اهتمامًا بأمراض القلب والأوعية الدموية (الجلطات الدموية وأمراض القلب وتصلب الشرايين) والحالات السريرية الأخرى (الاكتئاب ومرض الزهايمر وهشاشة العظام ومضاعفات الحمل وما إلى ذلك). الطرق الحالية لتحليل الهوموسيستين، بما في ذلك المقايسة المناعية، باهظة الثمن. تم تطوير طريقة HPLC/MS/MS سريعة لتحليل الهوموسيستين للاستخدام السريري الروتيني في تحليل أعداد كبيرة من العينات. تم إجراء التأين بطريقة الرش الكهربائي. هذه الطريقة قابلة للتكرار ومحددة للغاية ودقيقة. وتتمثل مزايا هذه الطريقة أيضًا في انخفاض تكلفة الكواشف وسهولة تحضير العينات. ومن الممكن تحليل 500 عينة أو أكثر يوميا.

خاتمة

تجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من استخدام طرق المقايسة المناعية المحسنة بشكل كبير الآن، نظرًا للقيود التقنية الأساسية، فإن هذه الطريقة لن تتمتع أبدًا بالدقة والنوعية للمادة المستهدفة المماثلة لـ HPLC-MSMS، خاصة في وجود المستقلبات. وهذا لا يؤدي فقط إلى انخفاض دقة طريقة ELISA ونسبة عالية من النتائج الإيجابية والسلبية الكاذبة، ولكنه لا يسمح أيضًا بمقارنة النتائج التي تم الحصول عليها في الأقسام السريرية المختلفة باستخدام طريقة ELISA. إن استخدام HPLC-MS/MS يزيل هذا العيب ويسمح بإجراء تحليل محدد ودقيق وسريع لعدد كبير من العينات ذات الموثوقية العالية في وجود المستقلبات وغياب التداخل من المواد المصاحبة والداخلية الموجودة في البلازما والدم. من المرضى.

على الرغم من التكلفة العالية الواضحة للأداة المعقدة، كما هو موضح ممارسة العالممع التشغيل السليم، يدفع هذا المجمع تكاليفه خلال 1-2 سنوات. يحدث هذا أولاً وقبل كل شيء بسبب التكلفة المنخفضة لتحليل واحد بسبب التحليل المتزامن لعشرات ومئات المركبات وغياب الحاجة إلى شراء مجموعات تشخيصية باهظة الثمن. بالإضافة إلى ذلك، يتمتع المختبر بفرصة تطوير أي طرق تحليل ضرورية بشكل مستقل وعدم الاعتماد على الشركة المصنعة للمجموعة.

اختيار التكوين الصحيح للأجهزة

هناك عدد كبير من طرق قياس الطيف الكتلي المختلفة وأنواع مقاييس الطيف الكتلي المصممة لحل مجموعة واسعة من المشكلات - بدءًا من التحديد الهيكلي للجزيئات البروتينية الكبيرة المعقدة التي تزن مئات الآلاف من دالتون إلى التحليل الكمي الروتيني عالي الإنتاجية للجزيئات الصغيرة.

ل الحل الناجحنظرًا للمهمة، فإن أحد الشروط الرئيسية هو اختيار النوع المناسب من المعدات. لا يوجد جهاز عالمي يسمح لك بحل مجموعة كاملة من المشكلات التحليلية. وبالتالي، فإن الجهاز المصمم لحل مشكلة تحديد الكائنات الحية الدقيقة غير قادر على إجراء التحليل الكمي للجزيئات الصغيرة. والعكس صحيح. النقطة المهمة هي أنه على الرغم من ذلك اسم شائعهذه أجهزة مختلفة تمامًا تعمل على مبادئ فيزيائية مختلفة. في الحالة الأولى، هذا هو مطياف الكتلة وقت الرحلة مع مصدر التأين بالليزر - MALDI-TOF، وفي الحالة الثانية - رباعي ثلاثي مع التأين الكهربائي - HPLC-MSMS.

المعلمة الثانية الأكثر أهمية هي اختيار تكوين النظام الصحيح. هناك العديد من الشركات المصنعة الكبرى لمعدات قياس الطيف الكتلي. لا تتمتع أجهزة كل مصنع بنقاط القوة الخاصة بها فحسب، بل تتمتع أيضًا بنقاط الضعف التي يفضلون عادةً التزام الصمت بشأنها. تنتج كل شركة مصنعة خطها الخاص من الأجهزة. تتراوح تكلفة المجمع التحليلي الواحد من 100000 إلى 1000000 دولار أو أكثر. لن يؤدي اختيار الشركة المصنعة الأمثل والتكوين الصحيح للمعدات إلى توفير موارد مالية كبيرة فحسب، بل سيؤدي أيضًا إلى حل المهمة بشكل أكثر فعالية. ولسوء الحظ، هناك العديد من الأمثلة التي تم فيها إجراء تجهيزات مخبرية دون أخذ هذه العوامل بعين الاعتبار. والنتيجة هي المعدات الخاملة والمال الضائع.

العامل الثالث الذي يحدد التشغيل الناجح للمختبر هو الموظفين. يتطلب تشغيل مطياف الكتلة موظفين مؤهلين تأهيلاً عاليًا. لسوء الحظ، لا توجد جامعة واحدة في روسيا لديها دورة في قياس الطيف الكتلي العملي الحديث، خاصة فيما يتعلق بالتطبيقات السريرية، ويجب حل مهام تدريب الموظفين في كل مختبر بمفردهم. بطبيعة الحال، 2-3 أيام من التدريب التمهيدي الذي تجريه الشركة المصنعة بعد إطلاق الجهاز لا يكفي على الإطلاق لفهم أساسيات الطريقة واكتساب المهارات في تشغيل الجهاز.

العامل الرابع هو عدم وجود طرق التحليل الجاهزة. كل مختبر لديه المهام ذات الأولوية الخاصة به، والتي من الضروري تطوير أساليبها الخاصة. يمكن القيام بذلك بواسطة شخص لديه خبرة لا تقل عن 2-3 سنوات في تشغيل الجهاز. يقوم المصنعون في بعض الأحيان بتوفير طريقة أو طريقتين عامتين ذات طبيعة توصية، ولكنهم لا يقومون بتكييفها مع المهام المحددة للمختبر.

في بيوفارم اكسبرت ذ.م.منحن نوظف متخصصين يتمتعون بسنوات عديدة من الخبرة في العمل على أنواع مختلفة من أجهزة قياس الطيف الكتلي، بالإضافة إلى تطوير الأساليب وإجراء تحليلات عالية الإنتاجية. ولذلك نحن نقدم الخدمات التالية:

1. اختيار تكوين الجهاز الأمثل للمهام المحددة للعميل.
2. شراء وتوريد وإطلاق المعدات من الشركات المصنعة الرائدة لأجهزة قياس الطيف الكتلي الترادفي، وتدريب الموظفين خطوة بخطوة خلال عام من تاريخ إطلاق المعدات.
3. مجموعة من التقنيات وقواعد البيانات الجاهزة لحل المشكلات السريرية الأساسية.
4. تطوير طرق التحليل وحل المشكلات المحددة للعميل في مختبره بمشاركة موظفيه.
5. الدعم المنهجي في جميع مراحل العمل.