Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ist eine Säulenchromatographiemethode, bei der die mobile Phase (MP) eine Flüssigkeit ist, die sich durch eine Chromatographiesäule bewegt, die mit einer stationären Phase (Sorbens) gefüllt ist. HPLC-Säulen zeichnen sich durch einen hohen hydraulischen Druck am Säuleneinlass aus, weshalb HPLC manchmal auch „Hochdruckflüssigkeitschromatographie“ genannt wird.

Abhängig vom Mechanismus der Stofftrennung werden folgende HPLC-Optionen unterschieden: Adsorption, Verteilung, Ionenaustausch, Größenausschluss, chiral usw.

Bei der Adsorptionschromatographie erfolgt die Trennung von Substanzen aufgrund ihrer unterschiedlichen Adsorptions- und Desorptionsfähigkeiten an der Oberfläche eines Adsorbens mit entwickelter Oberfläche, beispielsweise Kieselgel.

Bei der Verteilungs-HPLC erfolgt die Trennung aufgrund der unterschiedlichen Verteilungskoeffizienten der zu trennenden Substanzen zwischen der stationären Phase (normalerweise chemisch auf die Oberfläche eines stationären Trägers aufgepfropft) und der mobilen Phase.

Basierend auf der Polarität werden PF- und NP-HPLC in Normalphasen- und Umkehrphasen-HPLC unterteilt.

Normalphase ist eine Variante der Chromatographie, die ein polares Sorbens (z. B. Kieselgel oder Kieselgel mit gepfropften NH 2- oder CN-Gruppen) und ein unpolares PF (z. B. Hexan mit verschiedenen Zusätzen) verwendet. In der Umkehrphasenversion der Chromatographie werden unpolare chemisch modifizierte Sorbentien (z. B. unpolarer Alkylrest C 18) und polare mobile Phasen (z. B. Methanol, Acetonitril) verwendet.

Bei der Ionenaustauschchromatographie werden die in Lösung in Kationen und Anionen dissoziierten Moleküle eines Stoffgemisches bei der Bewegung durch ein Sorbens (Kationenaustauscher oder Anionenaustauscher) aufgrund ihrer unterschiedlichen Austauschgeschwindigkeit mit den ionischen Gruppen des Sorbens getrennt.

Bei der Größenausschlusschromatographie (Sieb, Gelpermeation, Gelfiltration) werden Stoffmoleküle aufgrund ihrer unterschiedlichen Fähigkeit, in die Poren der stationären Phase einzudringen, nach ihrer Größe getrennt. In diesem Fall verlassen die größten Moleküle (mit dem höchsten Molekulargewicht), die in die minimale Anzahl von Poren der stationären Phase eindringen können, als erste die Säule, und Substanzen mit kleinen Molekülgrößen verlassen die Säule als letzte.

Oft erfolgt die Trennung nicht durch einen, sondern durch mehrere Mechanismen gleichzeitig.

Mit der HPLC-Methode kann die Qualität aller nicht gasförmigen Analyten kontrolliert werden. Zur Durchführung der Analyse werden entsprechende Instrumente eingesetzt – Flüssigkeitschromatographen.

Ein Flüssigkeitschromatograph umfasst normalerweise die folgenden Hauptkomponenten:

– PF-Aufbereitungseinheit, einschließlich eines Behälters mit der mobilen Phase (oder Behältern mit einzelnen Lösungsmitteln, die in der mobilen Phase enthalten sind) und einem PF-Entgasungssystem;

– Pumpsystem;

– mobiler Phasenmischer (falls erforderlich);

– Probeneinführungssystem (Injektor);

– Chromatographiesäule (kann in einen Thermostat eingebaut werden);

– Detektor;

– Datenerfassungs- und -verarbeitungssystem.

Pumpsystem

Pumpen versorgen die Säule mit einer bestimmten konstanten Geschwindigkeit mit PF. Die Zusammensetzung der mobilen Phase kann während der Analyse konstant sein oder variieren. Im ersten Fall wird der Prozess als isokratisch und im zweiten Fall als Gradient bezeichnet. Um die mobile Phase zu filtern, werden manchmal Filter mit einem Porendurchmesser von 0,45 µm vor dem Pumpsystem installiert. Ein modernes Flüssigkeitschromatograph-Pumpsystem besteht aus einer oder mehreren computergesteuerten Pumpen. Dadurch können Sie die Zusammensetzung des PF gemäß einem bestimmten Programm während der Gradientenelution ändern. Das Mischen von PF-Komponenten in einem Mischer kann sowohl bei niedrigem Druck (vor den Pumpen) als auch bei hohem Druck (nach den Pumpen) erfolgen. Der Mischer kann zur Vorbereitung des PF und während der isokratischen Elution verwendet werden. Ein genaueres Verhältnis der Komponenten wird jedoch durch Vormischen der PF-Komponenten für den isokratischen Prozess erreicht. Pumpen für die analytische HPLC ermöglichen die Aufrechterhaltung einer konstanten Flussrate von PF in die Säule im Bereich von 0,1 bis 10 ml/min bei einem Druck am Säuleneingang von bis zu 50 MPa. Es wird jedoch empfohlen, dass dieser Wert 20 MPa nicht überschreitet. Druckpulsationen werden durch spezielle Dämpfersysteme minimiert, die in die Konstruktion der Pumpen integriert sind. Die Arbeitsteile der Pumpen bestehen aus korrosionsbeständigen Materialien, was die Verwendung aggressiver Komponenten in der PF-Zusammensetzung ermöglicht.

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Zur Identifizierung und Quantifizierung des neuen 1,3,4-Thiadiazol-Aminosäurederivats LXT7-09 wurde eine validierte HPLC-MS/MS-Methode entwickelt. Die maximale Empfindlichkeit des massenspektrometrischen Nachweises von LHT7-09 wurde im Positivionen-Detektionsmodus bei einer Elektrospray-Spannung von 5500 V und einem Declustering-Potential von 36 V erreicht. Die identifizierten MRM-Übergänge bestätigten die chemische Struktur des neuen Aminosäurederivats von 1 ,3,4-Thiadiazol. Um LXT7-09 effektiv aus Mehrkomponentenmischungen von Thiadiazolylamiden zu isolieren, wurde ein Gradientenmodus der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie entwickelt, bei dem eine Mischung aus Acetonitril und entionisiertem Wasser in unterschiedlichen Verhältnissen als Elutionsmittel verwendet wurde. Für diese chromatographischen Bedingungen wurde die Retentionszeit der Verbindung LHT7-09 mit 11 Minuten bestimmt. Zur quantitativen Bestimmung der Verbindung LHT7-09 wurde eine Kalibrierlösung für die Abhängigkeit der chromatographischen Peakfläche von der Lösungskonzentration entwickelt.

HPLC-ms/ms

Chromatographie

Massenspektrometer

Thiadiazol

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Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit massenspektrometrischer Detektion ist eine der vielversprechendsten Methoden zur Identifizierung und quantitativen Bestimmung von Arzneimitteln in verschiedenen biologischen Objekten. Die Methode zeichnet sich durch eine hohe Spezifität, Genauigkeit und die Fähigkeit zur Bestimmung von Substanzen in minimalen Konzentrationen aus und ermöglicht den Einsatz zur quantitativen Bestimmung von Arzneimitteln im Rahmen pharmakokinetischer Studien und des Arzneimittelmonitorings, was für die klinische Labordiagnostik von Bedeutung ist. Hierzu ist die Entwicklung und Validierung von Methoden zur quantitativen Bestimmung verschiedener, auch innovativer Arzneistoffe auf Basis der HPLC-MS/MS-Methode erforderlich.

Das Originalarzneimittel aus der Gruppe der nichtsteroidalen Antirheumatika ist Acexazolamid, ein neues Derivat von 1,3,4-Thiadiazolamid und Acexamsäure. Ein wesentlicher Vorteil dieser Verbindung ist ihre geringe Toxizität und geringe Ulzerogenität. Um pharmakokinetische Studien durchzuführen und die Bioverfügbarkeit dieses Arzneimittels über verschiedene Verabreichungswege zu beurteilen, ist es notwendig, eine zuverlässige Methode für seine quantitative Bestimmung in biologischen Flüssigkeiten zu entwickeln.

Der Zweck dieser Studie war die Entwicklung einer Technik zur Identifizierung und quantitativen Bestimmung eines neuen nichtsteroidalen Antiphlogistikums aus der Gruppe der Thiadiazol-Derivate mittels HPLC-MS/MS.

Materialen und Methoden

Gegenstand der Studie war ein neues Derivat von Thiadiazol mit dem Laborcode LHT 7-09, synthetisiert bei OJSC „VNTs BAV“ (Staraya Kupavna) von Prof. S.Ya. Skachilova (Abb. 1).

2-(5-Ethyl-1,3,4-thiadiazolyl)amid-2-acetylaminohexansäure

Reis. 1. Chemische Struktur von LHT 7-09 (Bruttoformel: C 12 H 20).N 4 O 2S; Molmasse 284,4 g/mol)

Anschluss LHT 7-09 Aussehen ist ein Pulver Weiß, das in Wasser praktisch unlöslich, in Alkohol löslich und in Acetonitril leicht löslich ist.

Zur Identifizierung und Quantifizierung von LCT 7-09 wurde eine validierte Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit massenspektrometrischer Detektion (HPLC-MS/MS) verwendet.

Die Chromatographie wurde mit einem Hochleistungsflüssigkeitschromatographen Agilent 1260 InfinityII (Agilent Technologies, Deutschland) durchgeführt. In der Studie wurde eine Agilent Poroshell 120 EC-C18 2,7 µm 2,1 x 10 mm Analysesäule verwendet. Um die untersuchte Verbindung zu isolieren, haben wir einen Gradientenchromatographiemodus entwickelt. Als Elutionsmittel wurden Acetonitril, entionisiertes Wasser und Ammoniumacetat in verschiedenen Verhältnissen verwendet.

Für die Massenspektrometrie wurde ein Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer ABSciexQTrap 3200 MD (ABSciex, Singapur) mit einer Elektrospray-Ionenquelle (TurboV mit TurboIonSpray-Sonde) verwendet. Das Massenspektrometer wurde mit einer Reserpin-Testlösung in einer Konzentration von 6,1 x 10 -2 mg/l kalibriert.

Die massenspektrometrische Analyse der untersuchten Proben wurde im Elektrospray-Modus mit direkter Injektion der vom Chromatographen gelieferten Probe und des Eluats durchgeführt. Die direkte Injektion der Testproben in den Massenchromatographen erfolgte mit einer Spritzenpumpe mit einem Durchmesser von 4,61 mm und einer Geschwindigkeit von 10 μl/min.

Bei der Entwicklung einer Methode zur Identifizierung und Quantifizierung eines neuen Thiadiazol-Derivats wurden optimale Bedingungen für Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Massendetektion ausgewählt. Der Zeitpunkt der Freisetzung des Stoffes aus der Chromatographiesäule und der MRM-Übergang wurden berücksichtigt (Registrierung wurde durchgeführt). M/z Vorläuferion auf dem ersten analytischen Quadrupol Q1 und M/z Produktionen auf dem zweiten analytischen Quadrupol Q3). Zur Quantifizierung von LCT 7-09 wurde eine Kalibrierungskurve im Konzentrationsbereich von 0,397 bis 397 ng/ml erstellt.

Als Software Es wurde AnalystMD 1.6.2.Software (ABSciex) verwendet.

Resultate und Diskussion

In der ersten Phase der experimentellen Studie wurde der Massennachweis der Testprobe durchgeführt, indem diese mit einer Spritzenpumpe direkt in den Massendetektor eingeführt wurde. Bei der Probenvorbereitung wurde eine Lösung von LHT 7-09 (500 ng/ml) in einer Mischung aus Acetonitril und ionisiertem Wasser im Verhältnis 2:1 unter Zusatz von Ammoniumacetat (0,1 %) hergestellt.

Vorläufige Experimente zeigten, dass bei der Registrierung positiver Ionen die Empfindlichkeit der Bestimmung von LHT 7-09 höher war und das Massenspektrum intensiver und aussagekräftiger war als bei der Registrierung negativer Ionen. Diesbezüglich wurde in weiteren Studien nur der positive Ionisationsmodus verwendet.

Um einen intensiven Höhepunkt zu erhalten, haben wir ausgewählt folgenden Bedingungen Massenerkennung : positive Polarisation, Elektrospray-Spannung 5500,0 V, Declustering-Potenzial und Injektionspotential – 36,0 bzw. 6,5 V, mit Vorhanggasdruck von 20,0 psi und Zerstäubungsgasdruck von 40,0 psi, Geschwindigkeit 10 μl/min. Der Scanbereich betrug 270–300 Da.

Die Analyse des erhaltenen Massenspektrums des ersten analytischen Quadrupols Q1 zeigte, dass unter diesen Bedingungen durch die Zugabe eines Wasserstoffprotons ein protoniertes Molekül der untersuchten Verbindung + mit dem Wert gebildet wird M/ z 285,2 Ja (Abb. 2).

Reis. 2. Massenspektrum des protonierten Moleküls LHT 7-09 (im Positivionen- und Scanmodus)

Auf dem zweiten analytischen Quadrupol Q3 wurden Produktionen für das Vorläuferion mit dem Wert aufgezeichnet m/z 285,2 Ja. Die Analyse des Massenspektrums 2. Ordnung zeigte das Vorhandensein vieler Peaks, von denen 3 die intensivsten waren – m/z 114,2 Da, m/z 130,2 Da und m/z 75,1 Da (Abb. 3).

Reis. 3. Massenspektrum von Produkt-Ionen (im Scanmodus für positive Ionen, Vorläuferion).M/ z285,2 Ja)

Um ein hochintensives Ionensignal zu erhalten, wurden die optimalen Energiewerte in der Q2-Kollisionszelle ausgewählt (berücksichtigt wurde der Energiebereich von 0 bis 400 V). Für Produktionen mit Werten M/ z 114,2 Da, 130,2 Da und 75,1 Da. Die optimale Energie in der Kollisionszelle betrug jeweils 27 V; 23 V und 49 V.

Es wird davon ausgegangen, dass die Produktion mit dem Wert M/ z 114,2 Da ist ein Fragment von 5-Amino-2-ethyl-1,3,4-thiadiazol, da auch die Fragmentierung anderer 1,3,4-Thiadiazol-Derivate ein Produkt-Ion mit demselben Wert ergibt M/ z. Produktion mit Bedeutung M/ z 130,2 Da ist wahrscheinlich eine protonierte Einheit von Acexamsäure. Somit bestätigten die Ergebnisse der Massendetektion der untersuchten Probe die chemische Struktur des neuen 1,3,4-Thiadiazol-Derivats.

Im nächsten Schritt der experimentellen Studie wurde die Testverbindung mittels HPLC-Massenspektrometrie analysiert.

Im HPLC-MS/MS-Modus wurden die folgenden Ionisierungsbedingungen verwendet: Elektrospray-Spannung 5500,0 V, Flussrate der mobilen Phase 400 μL/min, Stickstofftemperatur 400 °C, Vorhanggas- und Sprühflussdruck 20,0 bzw. 50,0 psi. Die Aufnahmegeschwindigkeit einzelner Massenspektren betrug 100 Spektren pro Sekunde. Um das zusammengefasste Massenspektrum zu erhalten, wurde auf dem Chromatogramm ein Zeitraum von 10,5–11,5 Minuten gewählt; Basierend auf der Intensität des Signals von Produktionen wurden Kurven der Zeitabhängigkeit des Ionenstroms und der Peakfläche einzelner Signale entsprechend der untersuchten Verbindung erstellt. Das Volumen der in die analytische Säule eingebrachten Probe betrug 10 μl.

Zur Isolierung der untersuchten Verbindung wurde ein Gradientenmodus der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie verwendet, der durch Änderung der Zusammensetzung des Eluenten am Eingang der Analysesäule sichergestellt wurde. Als Elutionsmittel wurden Acetonitril, entionisiertes Wasser und Ammoniumacetat in verschiedenen Verhältnissen verwendet. Die Wahl des Gradientenchromatographiemodus war darauf zurückzuführen, dass es unter den Bedingungen eines isokratischen Elutionsmodus (auch bei Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen von Acetonitril) nicht möglich war, einen Peak der Testsubstanz mit symmetrischer Form und Retentionszeit zu erhalten zur Analyse geeignet. Der Studie zufolge war der optimale Modus der Elutionsmittelzufuhr: Von 0 bis 4 Minuten betrug die Acetonitrilkonzentration 1 %; von 4 bis 8 Minuten ein linearer Anstieg der Acetonitrilkonzentration auf 99 %; von 8 bis 12 Minuten – isokratischer Abschnitt (1 % Acetonitril). Nach Abschluss der Studie wurde die Chromatographiesäule 5 Minuten lang mit einer 30 %igen Acetonitrillösung gewaschen.

Bei Verwendung des beschriebenen Chromatographiemodus wurde für die untersuchte Verbindung ein symmetrischer Peak ausreichender Intensität erhalten (Abb. 4).

Reis. 4. Chromatogramm LHT 7-09 (analytische SäuleAgilentPoroshell 120 EC-C18 2,7 µm 2,1×10 mm; Gradientenchromatographie-Modus)

Die Analyse der erhaltenen Chromatogramme für LCT 7-09-Lösungen unterschiedlicher Konzentration zeigte, dass die Retentionszeit (tR) unter diesen Elutionsbedingungen 11 Minuten betrug und nicht von der Konzentration der untersuchten Substanz abhing. In diesem Zusammenhang kann der Retentionszeitwert als zusätzliches Kriterium zur Bestätigung der Echtheit von LHT 7-09 in Mehrkomponentenmischungen herangezogen werden. Bemerkenswert ist die Tatsache, dass diese Chromatographieparameter zur Identifizierung von LHT 7-09 nicht nur mit einem Massendetektor, sondern auch mit anderen Detektoren, einschließlich photometrischen, verwendet werden können.

Zur Quantifizierung des neuen Thiadiazol-Derivats wurde eine Kalibrierkurve im Konzentrationsbereich von 0,397 ng/ml bis 397 ng/ml erstellt (Abb. 5).

Reis. 5. Kalibrierungsdiagramm zur Bestimmung der Konzentration von LCT 7-09 (auf der Abszisse ist die Konzentration von LCT 7-09 in ng/ml aufgetragen, auf der Ordinate ist die Peakfläche in Impulsen aufgetragen)

Zur Entwicklung einer Kalibrierlösung wurden Lösungen von LHT 7-09 in Konzentrationen von 0,397; 1,980; 3,970; 19,8; 39,7; 198,0; 397,0 ng/ml. Die Abhängigkeit der Peakfläche von der Konzentration der untersuchten Verbindung wurde durch die folgende Regressionsgleichung beschrieben:

y= 8,9e 5 ·x 0,499, der Wert des Regressionskoeffizienten betrug r=0,9936.

Es ist zu beachten, dass die entwickelte Kalibrierungslösung eine hochpräzise quantitative Bestimmung der untersuchten Verbindung in einem weiten Konzentrationsbereich ermöglicht, was es ermöglicht, diese Methode zur Beurteilung der Qualität eines Arzneimittels und zur Durchführung pharmakokinetischer Studien zu verwenden.

Das Ergebnis der Studie war somit die Entwicklung einer Methode zur Identifizierung und Quantifizierung eines neuen Aminosäurederivats von Thiadiazol mittels HPLC-MS/MS.

Schlussfolgerungen

1. HPLC-MS/MS ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung eines neuen Aminosäurederivats von Thiadiazol mit hoher Genauigkeit.
2. Der Massennachweis des neuen Thiadiazol-Derivats LHT 7-09 sollte im Positiv-Ionen-Scanmodus (MRM-Übergang – Vorläuferion Q1) erfolgen M/ z 285,2 Ja; Produktionen Q3 M/ z 114,2 Da, M/ z 130,2 Da und M/ z 75,1 Da).
3. Um LCT 7-09 aus Mehrkomponentengemischen zu isolieren, wurde eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographietechnik entwickelt (analytische Säule Agilent Poroshell 120 EC-C18 2,7 μm 2,1×10 mm; Eluent Acetonitril: entionisiertes Wasser: Ammoniumacetat; Gradientenmodus).

Bibliografischer Link

Popov N.S., Malygin A.S., Demidova M.A. ENTWICKLUNG EINER HPLC-MS/MS-METHODE ZUR IDENTIFIZIERUNG UND QUANTITATIVEN BESTIMMUNG EINES NEUEN THIADIAZOL-DERIVATS // Moderne Probleme von Wissenschaft und Bildung. – 2017. – Nr. 5.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=26988 (Zugriffsdatum: 01.02.2020). Wir machen Sie auf Zeitschriften des Verlags „Academy of Natural Sciences“ aufmerksam.

Stichworte

STEROIDE / LIPIDE / BLUTSERUM / STOFFWECHSELPROFIL / INDUSTRIEABFÄLLE/ STEROIDE / LIPIDE / BLUTSERUM / STOFFWECHSELPROFIL / INDUSTRIEABFÄLLE

Anmerkung wissenschaftlicher Artikel über Veterinärwissenschaften, Autor der wissenschaftlichen Arbeit - Chakhovsky Pavel Anatolyevich, Yantsevich Alexey Viktorovich, Dmitrochenko Alesya Egorovna, Ivanchik Alexander Viktorovich

Auswirkungen anthropogene Faktoren hat eine vielfältige Wirkung auf den menschlichen und tierischen Körper. Aufgrund ihrer komplexen Wirkung ist es schwierig, die negativen Auswirkungen einzelner Faktoren zu identifizieren. Die metabolomische Methodik, die es ermöglicht, diese Schwierigkeiten zu überwinden, wurde verwendet, um die Art und das Ausmaß des Einflusses von Abfällen aus der Produktion von Kaliumdüngern auf die Lipidprofile von Versuchstieren während der intranasalen Grundierung mit Abfällen aus der Produktion von Kaliumdüngern zu bewerten Verbrauch Wasser trinken, gewonnen aus Quellen in der potenziellen Zone der Kaliproduktion. Die Abtrennung der Lipide vom Serum erfolgte mit einer speziell entwickelten Technik auf Basis der Festphasenextraktion, die es ermöglicht, Cholesterin aus den Proben zu entfernen. Jede Probe wurde durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit massenspektrometrischer Detektion (HPLC-MS) analysiert. Anschließend wurden die resultierenden Chromatogramme mithilfe der Hauptkomponentenanalyse (PCA) und der Clusteranalyse verarbeitet. Die entwickelte Technik ermöglicht es, hydrophobe Metaboliten im Blutserum effektiv abzutrennen. Das Lipidprofil des Blutserums von Versuchstieren wurde ermittelt, insbesondere der Gehalt an Phospholipiden und Oxysteroiden, und es wurden Unterschiede in den Stoffwechselprozessen zwischen Versuchs- und Kontrolltieren festgestellt. Im Blutserum der Versuchstiere war die Konzentration an Oxysteroiden im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöht.

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Text einer wissenschaftlichen Arbeit zum Thema „HPLC-MS-Methode zur Analyse von Lipidprofilen von Meerschweinchenblutserum zur Erkennung früher Veränderungen im Stoffwechsel bei Exposition gegenüber Umweltschadstoffen“

[Hyänen und Hygiene 3/2014

Chakhovsky P.A.1, Yantsevich A.V.2, Dmitrochenko A.E.2, Ivanchik A.V.2

HPLC-MS-TECHNIK ZUR ANALYSE VON SERUMLIPIDPROFILEN

Meerschweinchen sollen frühzeitig Stoffwechselveränderungen erkennen, wenn sie Umweltschadstoffen ausgesetzt sind

TU „Republikanisches wissenschaftliches und praktisches Zentrum für Hygiene“, 220012, Minsk, Republik Weißrussland; ^Institut für Bioorganische Chemie der Nationalen Akademie der Wissenschaften von Belarus, 220141, Minsk, Republik Belarus

Der Einfluss anthropogener Faktoren hat vielfältige Auswirkungen auf den menschlichen und tierischen Körper. Aufgrund ihrer komplexen Wirkung ist es schwierig, die negativen Auswirkungen einzelner Faktoren zu identifizieren. Die Metabolomics-Methodik, die es ermöglicht, diese Schwierigkeiten zu überwinden, wurde verwendet, um die Art und das Ausmaß des Einflusses von Abfällen aus der Produktion von Kalidüngemitteln auf die Lipidprofile von Versuchstieren während der intranasalen Inokulation mit Abfällen aus der Produktion von Kalidüngemitteln und dem Verzehr zu bewerten von Trinkwasser aus Quellen, die im potenziellen Wirkungsbereich der Kaliproduktion liegen. Die Abtrennung der Lipide vom Serum erfolgte mit einer speziell entwickelten Technik auf Basis der Festphasenextraktion, die es ermöglicht, Cholesterin aus den Proben zu entfernen. Jede Probe wurde durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit massenspektrometrischer Detektion (HPLC-MS) analysiert. Anschließend wurden die resultierenden Chromatogramme mithilfe der Hauptkomponentenanalyse (PCA) und der Clusteranalyse verarbeitet. Die entwickelte Technik ermöglicht es, hydrophobe Metaboliten im Blutserum effektiv abzutrennen. Das Lipidprofil des Blutserums von Versuchstieren wurde ermittelt, insbesondere der Gehalt an Phospholipiden und Oxysteroiden, und es wurden Unterschiede in den Stoffwechselprozessen zwischen Versuchs- und Kontrolltieren festgestellt. Im Blutserum der Versuchstiere war die Konzentration an Oxysteroiden im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöht.

Schlüsselwörter: Steroide; Lipide; Blutserum; Stoffwechselprofil; Industrieabfälle.

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1Republikanisches wissenschaftliches und praktisches Zentrum für Hygiene, Minsk, Republik Belarus, 220012; 2Institut für Bioorganische Chemie, Minsk, Republik Belarus, 220141

für Korrespondenz: Chakhovsky Pavel Anatolyevich, chahovsky@gmail. com

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Schlüsselwörter: Steroide, Lipide, Blutserum, Stoffwechselprofil, Industrieabfälle.

Einführung

Eine der wichtigsten Aufgaben der Systembiologie und funktionellen Genetik ist die Integration von Proteomik, Transkriptomik und Informationen über im Körper ablaufende Stoffwechselprozesse. Jede im Körper auftretende Krankheit oder jeder pathologische Prozess spiegelt sich im Gehalt an niedermolekularen Metaboliten in Gewebe und Blut wider. Für die integralen Eigenschaften niedermolekularer Metaboliten im Blutplasma wurde 1971 der Begriff „metabolisches Profil“ eingeführt. Da die gleichzeitige Analyse mehrerer Metabolitenklassen äußerst komplex und unpraktisch ist, werden häufig eine Reihe von Techniken, einschließlich der Kernspinresonanzspektroskopie (NMR), zur Untersuchung von Stoffwechselprofilen eingesetzt hohe Auflösung und Chromatographie-Massenspektrometrie.

Bei der Durchführung metabolomischer Untersuchungen beschränkt man sich in der Regel auf eine bestimmte Gruppe von Stoffen, die bei der Probenvorbereitung von anderen Bestandteilen getrennt werden. Die resultierenden Gruppendaten sind einfacher zu interpretieren.

Stoffwechselprofile (insbesondere Urin und Blutplasma) können verwendet werden, um die Art physiologischer Veränderungen zu bestimmen, die durch die Aufnahme toxischer Verbindungen verursacht werden. In vielen Fällen können die beobachteten Veränderungen eine zusätzliche Charakterisierung spezifischer Läsionen wie Leber und Fettgewebe ermöglichen.

Die Analyse von Steroiden und Lipiden im Blutserum hat ein großes diagnostisches Potenzial. Die Lipidzusammensetzung des Blutserums, Steroidhormone, ihre Vorläufer und die Produkte ihrer Stoffwechselumwandlungen charakterisieren viele Funktionsparameter des Körpers. Diese Stoffe spielen eine wichtige koordinierende Rolle bei der Regulierung des Stoffwechsels und der Herz-Kreislauf-Funktion und sind an der Reaktion des Körpers auf akuten und chronischen Stress beteiligt.

Das Steroidprofil ist ein einzigartiges diagnostisches Kriterium für eine Reihe gynäkologischer und onkologischer Erkrankungen, die mit einer gestörten Synthese und Metabolisierung von Steroidhormonen einhergehen, während einige von ihnen nur anhand des Steroidprofils diagnostiziert werden können. Bei der Profilanalyse besteht die Möglichkeit der Verwendung absolute Werte als einfache Variablen und deren Vergleich mit der Norm. Allerdings kann es wichtiger sein, das Mengenverhältnis zu ändern. Darüber hinaus liefert das Steroidprofil gleichzeitig Informationen über eine Vielzahl von Steroiden.

Die Bestimmung des Serumsteroidprofils ist eine wirksame Methode zur Identifizierung nahezu aller Störungen des Steroidstoffwechsels, die eine Diagnose ermöglicht

genaue Diagnose in vielen klinischen Situationen, zum Beispiel bei angeborener Nebennierenhyperplasie, Typ-I-Hyperaldosteronismus, primärem Hyperaldosteronismus, Morbus Itsenko-Cushing, Nebenniereninsuffizienz usw. Das Steroidprofil ist wichtig bei der Diagnose von Störungen der sexuellen Differenzierung und der Gonadenfunktion sowie Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Insuffizienz.

Eine übermäßige Aufnahme von Salz, dem Hauptbestandteil von Kaliumdüngerabfällen, in den Körper von Versuchsratten mit Übergewicht führt zu einer übermäßigen Aktivierung der Aldosteronsynthese und verursacht Bluthochdruck und Nierenschäden mit metabolischem Syndrom.

In Regionen der industriellen Produktion mit hochgradig Aufgrund der Umweltverschmutzung ist die Morbiditätsrate der Bevölkerung in der Regel höher als in relativ „sauberen“ Regionen. Gegenstand unserer Forschung war die Stadt Soligorsk, die in der Zone des großflächigen Abbaus und der Verarbeitung von Kalierzen liegt. In den Bereichen von Salzdeponien und Schlammlagern von Kaliwerken hat sich eine Zone mit Chlorid-Natrium-Salzgehalt gebildet, die das Grundwasser bis zu einer Tiefe von mehr als 100 m bedeckt und sich auf die Verschmutzung von Trinkwasserquellen und atmosphärischer Luft auswirken kann .

Um die Auswirkungen der Belastung einzelner Umweltkomponenten im Bereich der industriellen Kalidüngemittelproduktion abzuschätzen, haben wir die Lipidprofile des Blutserums als Indikator für frühe Stoffwechselstörungen unter dem Einfluss eines Chemikaliengemisches analysiert.

Ziel der Arbeit ist die Identifizierung von Stoffwechselveränderungen bei Labortieren, die Abfällen aus der Produktion von Kaliumdüngern und dem Verzehr von Trinkwasser aus potenziell von Produktionsabfällen betroffenen Quellen ausgesetzt sind, mithilfe der Methode der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit massenspektrometrischer Detektion (HPLC-MS).

Gegenstand der Untersuchung war das Blutserum von Versuchstieren (Meerschweinchen) der Versuchs- und Kontrollgruppe.

Materialen und Methoden

Experimentelle Studien durchgeführt an 35 Meerschweinchen (17 Weibchen und 18 Männchen) mit einem Gewicht von 305–347 g.

[Hyäne und Hygiene 3/2014

Versuchsgruppe (Vorbereitung mit Abfällen aus der industriellen Produktion von Kalidüngemitteln und Trinkwasser aus dem Wasserversorgungssystem von Soligorsk), 20 Personen (10 Frauen und 10 Männer);

Kontrollgruppe (Grundierung mit isotonischer Natriumchloridlösung, um die Auswirkungen des durch die Grundierung verursachten Stressfaktors auszuschließen), 15 Personen (8 Männer und 7 Frauen).

Während des Experiments wurden der Allgemeinzustand der Tiere sowie der Futter- und Wasserverbrauch täglich überwacht.

Zur Modellierung der chronischen inhalativen Exposition (12 Wochen) gegenüber Abfällen aus der Produktion von Kaliumdüngern haben wir uns an der MU.Nr. 11-11-10-2002 „Anforderungen an die Durchführung toxikologischer und allergologischer Studien bei der hygienischen Regulierung proteinhaltiger Aerosole in“ orientiert der Luft des Arbeitsbereichs“, einschließlich der Bestimmung der Ansaugdosis. Proben aus Salzdeponien wurden in einem Marmormörser zu einem homogenen Staubzustand gemahlen und in destilliertem Wasser bis zur erforderlichen Konzentration gelöst, wobei das Körpergewicht der Versuchstiere berücksichtigt wurde (das Körpergewicht wurde wöchentlich überwacht, um die Dosis anzupassen). Die berechneten Dosen betrugen: zu Beginn des Experiments - 2,028 mg/0,1 cm3, nach 4 Wochen - 2,85 mg/0,1 cm3, nach 6 Wochen - 3,17 mg/0,1 cm3, nach 8 Wochen und bis zum Ende des Experiments 3,8 mg/0,1 cm3 cm3.

Ein Meerschweinchen ohne Narkose wurde in Rückenlage mit erhobenem Kopf fixiert und mit einem Pipettenspender (über 2-3 Minuten) abwechselnd eine Dosis warmer Lösung in die Nasenlöcher (fraktioniert) injiziert, um ein Niesen zu verhindern . Die daraus resultierenden „Quetschgeräusche“ bestätigten das Eindringen der Lösung in die Atemwege.

Die Versuchstiergruppe „inhalierte“ die Mischung einmal täglich, 5 Tage die Woche, 12 Wochen lang. Tiere der Kontrollgruppe „inhalierten“ Kochsalzlösung (0,9 % NaCl).

Zur Auswahl biologisches Material Die Tiere wurden betäubt (Äthernarkose) und nach der Enthauptung wurde Blut entnommen. Das Serum wurde durch 15-minütige Zentrifugation bei 3000 U/min gewonnen und für weitere Untersuchungen bei -20 °C gelagert. Phospholipide, Oxysteroide und Fettsäuren wurden im Blutserum analysiert.

Probenvorbereitung. Dem Blutserum wurde ein interner Standard, Progesteron, zugesetzt, um eine Konzentration von 10–5 M (10 μl pro 1 ml Probe) zu erreichen. Anschließend wurde zur Ausfällung der in der Probe enthaltenen Proteine ​​und zur Extraktion der Steroide Methanol bis zu einer Endkonzentration von 70 % (2,33 ml Methanol pro 1 ml Probe) zugegeben und anschließend 15 Minuten lang bei 10.000 g zentrifugiert. Die in der Probe enthaltenen Proteine ​​bildeten einen dichten Sediment. Der Überstand wurde vom Niederschlag abgetrennt und durch eine vorkonditionierte Festphasenextraktionssäule (SPE) geleitet, die 100 mg Octadecylsilyl-Kieselgel enthielt. Die SPE-Säule wurde konditioniert, indem nacheinander 2 ml Methanol, 2 ml Wasser und 2 ml 70 %iges Methanol durchgeleitet wurden. In der ersten Stufe bindet Cholesterin, dessen Gehalt im Blutplasma und anderen biologischen Flüssigkeiten recht hoch ist, sowie eine Reihe anderer stark hydrophober Lipide an die Säule. Nach der Bindung des Cholesterins wurde die Säule weiter mit 2 ml 70 %igem Methanol gewaschen. Wenn die Probe einen hohen Cholesteringehalt oder ein großes Probenvolumen aufweist, verwenden Sie

Wir verwendeten eine SPE-Säule mit einem hohen Sorbensgehalt. Die Eluate wurden vereinigt und eingedampft. Die Verdampfung erfolgte bei 50°C im Inertgasstrom. Der trockene Rückstand wurde in 500 μl Methanol gelöst und 10 min bei 10.000 g zentrifugiert. Dabei fielen in Methanol unlösliche polare Verbindungen aus. Der Überstand wurde vom Sediment abgetrennt und mit Wasser auf eine Methanolkonzentration von 10 % verdünnt. Die resultierende Lösung wurde durch eine vorkonditionierte SPE-Säule geleitet (2 ml Methanol, 2 ml Wasser und 2 ml 10 % Methanol wurden durchgeleitet) und mit 2 ml 10 % Methanol gewaschen. An die Säule gebundene Steroide wurden mit 3 ml 80 % Methanol eluiert. Die Lösung wurde eingedampft und der trockene Rückstand in 100 μl Methanol gelöst. Die resultierende Lösung wurde mittels HPLC-MS analysiert.

HPLC-Analyse. Die Analyse wurde auf einem Accela-Chromatographen durchgeführt, der mit einem LCQ-Fleet-Massenspektrometerdetektor ausgestattet war. Die Trennung wurde auf einer Cosmosil 5C18-MS-II-Säule mit geometrischen Parametern von 4,6 x 150 mm (Nacalai Tesque, Japan) durchgeführt.

Trennprogramm (Lösungsmittel A – Wasser, Lösungsmittel B – Methanol, Flussrate 500 µl/min): für 5 Min. 60 % B, 12 Min. – linearer Gradient 60–95 % B, 10 Min. – 95 % B, 8 Min. – linear Steigung 95–100 % B, 5 Min. – 100 % B, 5 Min. – 60 % B.

Für die massenspektrometrische Analyse wurde eine chemische Ionisationsquelle verwendet Luftdruck(APCI). Ionisationsquellenparameter: Verdampfertemperatur – 350 °C, Trocknungsgasfluss – 35 Einheiten, Hilfsgasfluss – 5 Einheiten, Kapillartemperatur – 275 °C, Kapillarspannung – 18 V, Ionenlinsenspannung – 80 V. Verwendetes Data Dependent™-Scannen Modus mit einer Ionenfalle im Scanbereich 50-1000 m/z.

Mit einem massenspektrometrischen Detektor im chemischen Ionisationsmodus (Gesamtionenstrom) erhaltene Chromatogramme wurden mit dem Qual Browser-Programm aus dem Xcalibur-Paket (Thermo Sci, USA) in ein Textformat umgewandelt. Die erhaltenen Informationen wurden mithilfe der im Statistica 10-Paket implementierten Hauptkomponentenmethode und Tools zur Clusteranalyse und Dendrogrammkonstruktion verarbeitet. Das Nachschlagewerk wurde zur Interpretation der Massenspektren und zur Identifizierung einzelner Verbindungen verwendet.

Resultate und Diskussion

Die ursprüngliche Methode zur Anpassung war die Methode der Festphasenextraktion von Steroiden aus Serum und Blutplasma, beschrieben im Macherey-Nagel-Handbuch zur Festphasenextraktion. Anwendungsleitfaden, der Empfehlungen für die Verwendung von Festphasenextraktionssäulen enthält. Eine angepasste Probenvorbereitungstechnik mit Festphasenextraktion ermöglichte die effektive Isolierung von Phospholipiden, Oxysteroiden und Fettsäuren aus dem Blutserum von Meerschweinchen.

Die beschriebene chromatographische Trenntechnik ermöglicht eine wirksame Trennung sowohl der im Serum vorhandenen Steroidhormone als auch der Lipide.

Die Proben wurden gemäß den beschriebenen Methoden analysiert. In Abb. 1 (siehe Seite 2 des Umschlags) zeigt beispielhaft überlagerte Chromatogramme, die aus der Analyse von 3 Proben der Versuchsgruppe (hervorgehoben) erhalten wurden

Reis. 4. Massenspektren einer Substanz mit einer Retentionszeit von 21,5 Minuten: a – chemische Ionisation bei Atmosphärendruck im negativen Modus; b – chemische Ionisation bei Atmosphärendruck im positiven Modus.

in rot) und 3 Proben aus der Kontrollgruppe (in blau). Ein ähnliches Bild zeigte sich auch in anderen Fällen.

Um diese Datensätze zu verarbeiten, verwendeten wir die Hauptkomponentenmethode (PCA) und die Clusteranalyse, die es ermöglichten, Unterschiede in den Lipidprofilen zwischen der Kontroll- und der Versuchsgruppe zu identifizieren. PCA-Diagramm der erhaltenen 1. und 2. Hauptkomponente

beim Reduzieren der Datendimension ist in Abb. dargestellt. 2 (siehe 2. Umschlagseite). In der Grafik ist leicht zu erkennen, dass die Punkte in zwei Gruppen zusammengefasst sind, die jeweils in den Quadranten 1, 4 und 2, 3 lokalisiert sind. Dabei fallen die den Prototypen entsprechenden Punkte überwiegend in den 1. und 4. Quadranten, die den Kontrollproben entsprechenden Punkte liegen im 2. und 3. Quadranten. Das durch Platzieren erhaltene Dendrogramm

[Hyäne und Hygiene 3/2014

Identifizierung der im Chromatogramm vorhandenen Peaks

Retentionszeit, min Hauptpeaks im „+“-Modus Hauptpeaks im „-“-Modus

19,15 393,7 446,8

448,7 493,5 623,4 524,4

19,35 87 227 271 335,5 353,3 371,2 389.1 448.2 493.3 405,4

21,50 316,1 390,0

430.3 448.4 779,1

23,8 319.4 391,6 429.5 783,2

24,35 414,8 448,8

31,73 313,3 330,9

33,9 231.5 245.5 263,3 281,1 295.1 305.2 371.3 521.0 663.1 279,4

Substanz

Phosphatidylcholin

Arachinsäure

Phosphatidsäure 42:4

Arachinsäure und Docosat-Traensäure

Docosapentaensäure

Linolsäure

Dihydroxycholesterin

Brustbeinanalyse, dargestellt in Abb. 3. Somit weist die statistische Analyse chromatographischer Daten auf Unterschiede in den Stoffwechselprozessen hin, die in den Organismen von Versuchstieren der Kontroll- und Versuchsgruppe ablaufen.

Um spezifische Stoffwechselveränderungen zu identifizieren, wurden Massenspektren entschlüsselt und identifiziert.

Es werden einzelne Anschlüsse angegeben (siehe Tabelle). Das Probenvolumen reichte für die Analyse nicht aus und erlaubte uns nicht, Veränderungen im Steroidhormonprofil im Serum festzustellen. Im Chromatogramm wurden jedoch Lipide mit mittlerer Polarität nachgewiesen.

Einzelne Verbindungen wurden durch Analyse der Massenspektren von Substanzen identifiziert, die bei verschiedenen Ionisationsmodi aufgezeichnet wurden. So ist in Abb. das Massenspektrum der Substanz in zwei Ionisationsmodi mit einer Retentionszeit von 21,5 min dargestellt. 4. Die Analyse dieses Spektrums ergab, dass es sich bei der Substanz um Diacyl-sn-glycerophosphat mit handelt Molekulargewicht 780 (R1(311) = 20:0 Fettsäure (Arachinsäure), R2(331) = 22:4 Fettsäure (Docosatetraensäure)).

Es wurde festgestellt, dass der chromatographische Peak mit einer Retentionszeit von 42,52 min Dihydroxycholesterin entspricht, vermutlich einem der Vorläufer bei der Biosynthese von Gallensäuren. Unterschiede im Gehalt an Oxysteroiden im Blutserum weisen auf eine mögliche Störung im Gallensäurestoffwechsel hin. Es ist zu erkennen, dass in den in Abb. 1, im Blutserum von Versuchstieren findet sich im Vergleich zur Kontrolle eine erhöhte Konzentration an Oxysteroiden (Peaks mit einer Retentionszeit von 35-45 Minuten).

Abschluss. Die in der Arbeit eingesetzte Technik ermöglicht es, Störungen des Lipidstoffwechsels bei Einwirkung von Umweltschadstoffen frühzeitig und mit hoher Effizienz zu erkennen. Die erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass die intranasale Verabreichung wässriger Lösungen von Salzhalden an Versuchstiere mit Cavia porcellus zu Veränderungen im Metabolismus von Lipiden und Oxysteroiden führt. Insbesondere die bei Tieren beobachteten erhöhten Konzentrationen von Gallensäurevorläufern (Hydroxysteroiden) können mit einer Funktionsstörung der Leber und von Enzymen, die an der Biosynthese von Gallensäuren beteiligt sind, in Zusammenhang stehen. Somit kann der beschriebene Ansatz genutzt werden, um Störungen des Fettstoffwechsels bei Bewohnern von Regionen mit technogener Belastung zu identifizieren.

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Zur Kunst. Chakhovsky et al.

Reis. 3. Dendrogramm, das auf der Grundlage der Clusteranalyse erstellt wurde und die Clusterung von Proben in Gruppen veranschaulicht.

Zur Kunst. Chakhovsky et al.

Reis. 1. Kombinierte Chromatogramme der Proben 1–3 der Kontrollgruppe (rot hervorgehoben) und 15–17 der Versuchsgruppe (blau hervorgehoben).

Projektion der Fälle auf die Faktorebene (1 x 2) Fälle mit der Kosinusquadratsumme >= 0,00

18/3 9/z 21/1 ■ O

1 Leihgabe „Sh o 28/1“ 22/10 41/1 S

Faktor 1: 65,71 %

Reis. 2. Diagramm, das durch die Verarbeitung von Chromatogrammen mit PCA erstellt wurde. Die Kontrollgruppe ist blau hervorgehoben, die Experimentalgruppe rot.

Laut einer in Clinical Biochemist Reviews veröffentlichten Übersicht hat der Einsatz von Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (HPLC-MS/MS) in klinischen Labors in den letzten 10 bis 12 Jahren enorm zugenommen. Die Autoren weisen darauf hin, dass die Spezifität der HPLC-MS/MS-Analyse den immunologischen Methoden und der klassischen Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) zur Analyse niedermolekularer Moleküle deutlich überlegen ist und einen deutlich höheren Durchsatz aufweist als die Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC). -MS). Die Beliebtheit dieser Methode in routinemäßigen klinischen Analysen erklärt sich derzeit aus den einzigartigen Fähigkeiten der Methode.

Die Hauptvorteile der HPLC-MS/MS-Methode sind:
• Möglichkeit einer genauen quantitativen Analyse kleiner Moleküle;
• Gleichzeitige Analyse mehrerer Zielverbindungen;
• Einzigartige Spezifität;
• Hohe Analysegeschwindigkeit.

IN letzten Jahren Der Analysezeit und damit der Steigerung der Laborproduktivität wird große Aufmerksamkeit geschenkt. Durch den Einsatz kurzer analytischer Säulen für HPLC/MS/MS wird eine deutliche Verkürzung der Analysezeit ermöglicht und gleichzeitig die Spezifität der Analyse deutlich erhöht. Der Einsatz von Atmosphärendruckionisation (API), Tandem-Triple-Quadrupol-Massenspektrometer und fortschrittlicher Hochleistungsflüssigkeitschromatographie sowie damit verbundener Probenvorbereitungstechniken hat HPLC-MS/MS an die Spitze moderner Analysemethoden für die klinische Forschung gebracht.

Hauptanwendungsgebiete von HPLC/MS/MS in der klinischen Medizin:
• Erhalten eines vollständigen Stoffwechselprofils von Steroiden, Purinen und Pyrimidinen und anderen Verbindungen,
  Screening von Neugeborenen auf angeborene Stoffwechselstörungen (Nachweis mehrerer Dutzend Krankheiten in einem Test);
• Therapeutische Überwachung von Arzneimitteln – Immunsuppressiva, Perotikonvulsiva, antiretroviralen Arzneimitteln, Antikoagulanzien und anderen – unabhängig von der Verfügbarkeit der Kits des Herstellers. Sie müssen keine teuren Kits für jede Substanz kaufen – Sie können Ihre eigenen Methoden entwickeln;
• Klinische Toxikologie – Analyse von mehr als 500 narkotischen Verbindungen und ihren Metaboliten in einer Analyse, ohne Bestätigungsanalyse
  Proteomik und Metabolomik.

Darüber hinaus wird HPLC-MSMS zum Screening von Oligosacchariden, Sulfatiden und langkettigen Harn-Oligosacchariden verwendet Fettsäuren, langkettige Gallensäuren, Methylmalonsäure, Forschung zu Porphyrien, Screening von Patienten mit Störungen des Purin- und Pyrimidinstoffwechsels.

Anwendungsbeispiele der Flüssigkeitschromatographie
in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie in klinischen Analysen.

Neugeborenenscreening: Das erste Beispiel für den weit verbreiteten Einsatz von HPLC-MS/MS in der klinischen Diagnostik war das Screening angeborener Stoffwechselstörungen bei Neugeborenen. Derzeit ist dies in entwickelten Ländern eine Routinemethode und deckt mehr als 30 verschiedene Krankheiten ab, darunter Acetämie, Aminoazidopathie und Fettsäureoxidationsdefekte. Besonders hervorzuheben sind Studien zu Geburtsfehlern, die zu schwerwiegenden Problemen führen können, wenn sie nicht umgehend behandelt werden (z. B. eine Vergrößerung des Herzens oder der Leber oder eine Schwellung des Gehirns). Der Vorteil des Einsatzes von HPLC-MS/MS beim Neugeborenen-Screening liegt in der Möglichkeit, alle Aminosäuren und Acylcarnitine gleichzeitig schnell, kostengünstig und hochspezifisch zu analysieren.

Therapeutisches Arzneimittelmonitoring: Die Entwicklung und Einführung des Immunsuppressivums Sirolimus (Rapamycin) zur Verhinderung einer Organabstoßung nach einer Transplantation war einer der Hauptgründe für die Einführung von HPLC-MS/MS in klinischen Labors. Moderne Methode HPLC-MS/MS ermöglicht die gleichzeitige Bestimmung von Tacrolimus, Sirolimus, Cyclosporin, Everolimus und Mycofensäure.

HPLC-MS/MS wird auch zur Analyse von zytotoxischen, antiretroviralen Arzneimitteln, trizyklischen Antidepressiva, Antikonvulsiva und anderen Arzneimitteln verwendet, die eine individuelle Dosierung erfordern.

Die HPLC-MSMS-Methode ermöglicht die Trennung und Quantifizierung der R- und S-Enantiomere von Warfarin im Konzentrationsbereich von 0,1–500 ng/ml.

Betäubungsmittel und Schmerzmittel: Aufgrund der einfachen Probenvorbereitung und der kurzen Analysezeit wird HPLC-MS/MS häufig für die Analyse dieser Verbindungen verwendet. Die Methode wird derzeit in klinischen Labors zum Screening auf das Vorhandensein einer Vielzahl von Arzneimitteln eingesetzt. Die einzigartige Spezifität und Empfindlichkeit der Methode ermöglicht die gleichzeitige Analyse von mehr als 500 Verbindungen verschiedener Klassen in einer Probe mit minimaler Probenvorbereitung. Bei der Urinanalyse reicht also eine einfache Verdünnung der Probe um das 50- bis 100-fache aus. Bei der Haaranalyse genügt statt einer Haarsträhne von 100-200 ein einzelnes Haar, um Hinweise auf einen Drogenkonsum zuverlässig zu erkennen.

Endokrinologie und Steroidanalyse: HPLC-MS/MS wird in vielen Endokrinologielabors häufig zur Analyse von Steroiden eingesetzt – Testosteron, Cortisol, Aldesteron, Progesteron, Östriol und viele andere.

Immer mehr Labore beginnen, HPLC-MS/MS zur Bestimmung der Vitamin D3- und D2-Blutspiegel einzusetzen.

I. Bestimmung von Steroiden (Steroidprofil).

Krankenhaus- und Kliniklabore haben nun die Möglichkeit, mithilfe von HPLC/MS/MS gleichzeitig mehrere Steroide zu bestimmen. In diesem Fall ist kein großes Probenvolumen erforderlich, was besonders bei der Analyse pädiatrischer Proben wichtig ist.

Fälle, in denen es ratsam ist, mehrere (Profilierungs-)Steroide zu bestimmen:
• Die angeborene Nebennierenhyperplasie (CAH) ist ein angeborener Defekt der Steroidbiosynthese. Dies ist eine erbliche Gruppe von Krankheiten, die durch eine fehlerhafte Aktivität von Enzymen in der Nebennierenrinde verursacht werden, was zu einer verminderten Cortisolproduktion führt. Für eine zuverlässige Diagnose von NAS wird empfohlen, Cortisol, Androstendion und 17-Hydroxyprogesteron zu messen. HPLC/MS/MS ermöglicht die genaue Quantifizierung aller drei Steroide in einer einzigen Analyse mit 100 %iger Sicherheit.
• Das routinemäßige Neugeborenen-Screening mittels Immunoassays ist durch eine hohe Rate positiver und falsch negativer Ergebnisse gekennzeichnet. Die Bestimmung nicht nur von Cortisol, sondern auch von Aldosteron und 11-Desoxycortisol mittels HPLC/MS/MS ermöglicht die Unterscheidung zwischen primärer und sekundärer Nebenniereninsuffizienz.
• HPLC/MS/MS ermöglicht die Bestimmung von Steroiden bei Prostatitis und chronischem Beckenschmerzsyndrom.
• HPLC-MS/MS kann Steroidprofile bestimmen und Ursachen für eine vorzeitige Pubertät im Zusammenhang mit der Nebennierenrinde bei kleinen Kindern identifizieren. Es wurde festgestellt, dass die Konzentrationen von Testosteron, Androstendion, Dehydroepiandrosteron (DHEA) und seinem Sulfat bei diesen Kindern etwas höher waren als bei älteren Kontrollkindern.
• Das Serum von aktiven Rauchern, Passivrauchern und Nichtrauchern wird auf das Vorhandensein von 15 Steroidhormonen und Schilddrüsenhormonen analysiert, um den Zusammenhang zwischen der Rauchexposition des Patienten und den Hormonkonzentrationen zu untersuchen.
• HPLC/MS/MS wird zur Profilierung einiger weiblicher Steroidhormone im Urin verwendet.
• HPLC/MS/MS wurde verwendet, um die Konzentrationen neuroaktiver Hormone zur Vorbeugung diabetischer Neuropathie zu bewerten.

II. Bestimmung von Schilddrüsenhormonen

Routinemethoden zur Bestimmung von Schilddrüsenhormonen basieren in der Regel auf Radioimmunoassays, die teuer sind und nur T3 und T4 nachweisen, was die Fähigkeit zur Bestimmung und vollständigen Regulierung der Schilddrüsenfunktion einschränken kann.

• Derzeit wird mittels HPLC-MSMS die gleichzeitige Analyse von fünf Schilddrüsenhormonen in Serumproben durchgeführt, darunter Thyroxin (T4), 3,3′,5-Triiodthyronin (T3), 3,3′,5′- (rT3). , 3,3'-Diiodthyronin (3,3'-T2) und 3,5-Diiodthyronin (3,5-T2) im Konzentrationsbereich 1 -500 ng/ml.
• Die HPLC/MS/MS-Methode wird auch zur Analyse der Hormonzusammensetzung bei Patienten nach einer Schilddrüsenentfernung eingesetzt. Es werden die Konzentrationen von Thyroxin (T4), Trijodthyronin (T3), freiem T4 und Schilddrüsen-stimulierendem Hormon (TSH) nach der Operation bestimmt. HPLC/MS/MS hat sich als hervorragende Möglichkeit erwiesen, den Zusammenhang zwischen TSH- und Schilddrüsenhormonkonzentrationen festzustellen.
• Zur Bestimmung von Thyroxin (T4) in menschlichem Speichel und Serum wurde die HPLC/MS/MS-Methode verwendet. Die Methode zeichnet sich durch hohe Reproduzierbarkeit, Genauigkeit und eine Nachweisgrenze von 25 pg/ml aus. Studien haben gezeigt, dass ein diagnostischer Zusammenhang zwischen den T4-Konzentrationen im Speichel zwischen euthyreoten Probanden und Patienten mit Morbus Basedow besteht.

Die HPLC/MS/MS-Methode verfügt nun über die erforderliche Sensitivität, Spezifität und Genauigkeit für die zuverlässige Bestimmung aller Steroide in biologischen Flüssigkeiten und verbessert damit die diagnostischen Möglichkeiten, insbesondere bei der Bestimmung von Steroidsätzen.

III. Bestimmung von 25-Hydroxyvitamin D mittels HPLC/MS/MS

25-Hydroxy-Vitamin D (25OD) ist die wichtigste zirkulierende Form von Vitamin D und die Vorstufe seiner aktiven Form. (1,25-Dihydroxyvitamin D). Aufgrund seiner langen Halbwertszeit ist die Bestimmung von 25OD wichtig für die Bestimmung des Vitamin-D-Status im Körper des Patienten. Vitamin D kommt in zwei Formen vor: Vitamin D3 (Cholecalciferol) und Vitamin D2 (Ergocalciferol). Beide Formen werden in ihre jeweiligen 25OD-Formen metabolisiert. Von großer Bedeutung für die Diagnose ist die Verfügbarkeit analytischer Methoden, die beide Formen des Vitamins mit hoher Genauigkeit bestimmen können und eine Überwachung von Patienten mit Vitamin-D-Mangel ermöglichen. Die bisher verwendeten Methoden ermöglichten keine getrennte Bestimmung von Vitamin D2 und D3. Zudem wird bei hohen Konzentrationen an Vitamin D2 die nachweisbare Menge an D3 unterschätzt. Ein weiterer Nachteil ist die Verwendung radioaktiver Isotope. Durch den Einsatz der HPLC/MS/MS-Methode konnte nicht nur der Einsatz radioaktiver Isotope vermieden, sondern auch eine getrennte Bestimmung beider aktiver Formen des Vitamins durchgeführt werden.

Die Methode ist für folgende Patienten anwendbar:
1. Wenn Sie einen niedrigen Vitamin-D-Spiegel im Körper vermuten;
2. Bei Verdacht auf ungeklärte Toxizität;
3. Bei der Untersuchung von Patienten, die wegen eines niedrigen Vitamin-D-Spiegels behandelt werden;
4. Der Einsatz von HPLC/MS/MS ermöglichte die getrennte Bestimmung beider Formen bei der Patientenüberwachung.

IV. Bestimmung von Immunsuppressiva mittels HPLC/MS/MS

Nach einer Organtransplantation müssen lebenslang immunsuppressive Medikamente eingenommen werden, um eine Abstoßung zu vermeiden. Aufgrund ihres sehr engen therapeutischen Spektrums und ihrer hohen Toxizität erfordern Immunsuppressiva eine individuelle Dosierung, um eine maximale Wirkung zu erzielen. Daher ist die Überwachung der wichtigsten Immunsuppressiva: Cyclosporin A, Tacrolimus, Sirolimus und Everolimus von entscheidender Bedeutung, um die Medikamentendosis für jeden einzelnen Patienten abhängig von der Konzentration des Medikaments im Blut anzupassen.

Zur Überwachung dieser Medikamente werden immer noch Immunoassays eingesetzt, diese Methoden sind jedoch teuer und weisen eine begrenzte Spezifität, Genauigkeit und Reproduzierbarkeit auf. Basierend auf den Ergebnissen immunologischer Methoden gibt es Fälle von Todesfällen von Patienten durch falsche Dosierung von Immunsuppressiva. Derzeit werden Immunoassays in klinischen Laboren durch HPLC/MS/MS ersetzt. So werden am Universitätsklinikum München täglich etwa 70 Proben mit einem HPLC/MS/MS-System auf den Gehalt an Sirolimus und Cyclosporin A untersucht. Die gesamte Probenvorbereitung und Gerätekontrolle wird von einem Mitarbeiter durchgeführt. Auch das Labor stellt auf die Testung von Tacrolimus mit dieser Methode um.

• Beschrieben wird die Verwendung von HPLC/MS/MS zur routinemäßigen gleichzeitigen Bestimmung von Tacrolimus, Sirolimus, Ascomycin, Demethixisirolimus, Cyclosporin A und Cyclosporin G im Blut. Der durch die Konzentration bestimmte Bereich liegt zwischen 1,0 und 80,0 ng/ml. Für Cyclosporin 25 - 2000 ng/ml. Im Laufe des Jahres analysierte das Labor mehr als 50.000 Proben.
• Da festgestellt wurde, dass die gleichzeitige Anwendung von Tacrolimus und Sirolimus einen positiven therapeutischen Effekt hat, wurde eine einfache und effektive HPLC/MS/MS-Methode für deren getrennte Bestimmung im Blut für die klinische Analyse entwickelt. Die Analyse einer Probe dauert 2,5 Minuten mit einer Genauigkeit von 2,46 % bis 7,04 % für Tacrolimus und 5,22 % bis 8,30 % für Sirolimus für die gesamte Analysekurve. Die untere Nachweisgrenze für Tacrolimus liegt bei 0,52 ng/ml, für Sirolimus bei 0,47 ng/ml.

V. Bestimmung von Homocystein mittels HPLC/MS/MS

Homocystein ist bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen (Thromboembolie, Herzerkrankungen, Arteriosklerose) und anderen klinischen Zuständen (Depression, Alzheimer-Krankheit, Osteoporose, Schwangerschaftskomplikationen usw.) von Interesse. Aktuelle Methoden zur Homocystein-Analyse, einschließlich Immunoassays, sind teuer. Eine schnelle HPLC/MS/MS-Methode zur Analyse von Homocystein wurde für den routinemäßigen klinischen Einsatz bei der Analyse einer großen Anzahl von Proben entwickelt. Die Ionisierung erfolgte mittels Elektrospray-Methode. Die Methode ist reproduzierbar, hochspezifisch und genau. Zu den Vorteilen der Methode zählen außerdem die geringen Kosten für Reagenzien und die einfache Probenvorbereitung. Es ist möglich, 500 oder mehr Proben pro Tag zu analysieren.

Abschluss

Es ist zu beachten, dass trotz der Verwendung deutlich verbesserter Immunoassay-Methoden aufgrund grundlegender technischer Einschränkungen diese Methode niemals die mit HPLC-MSMS vergleichbare Genauigkeit und Spezifität für die Zielsubstanz aufweisen wird, insbesondere in Gegenwart von Metaboliten. Dies führt nicht nur zu einer geringen Genauigkeit der ELISA-Methode und einem hohen Prozentsatz falsch positiver und falsch negativer Ergebnisse, sondern ermöglicht auch keinen Vergleich der Ergebnisse, die in verschiedenen klinischen Abteilungen mit der ELISA-Methode erzielt wurden. Der Einsatz von HPLC-MS/MS beseitigt diesen Nachteil und ermöglicht eine hochspezifische, genaue und schnelle Analyse einer großen Anzahl von Proben mit hoher Zuverlässigkeit in Gegenwart von Metaboliten und ohne Störungen durch begleitende und endogene Substanzen im Plasma und Blut der Patienten.

Trotz der scheinbar hohen Kosten des Instrumentenkomplexes, wie gezeigt Weltpraxis Bei ordnungsgemäßem Betrieb amortisiert sich dieser Komplex in 1-2 Jahren. Dies liegt vor allem an den geringen Kosten einer Analyse aufgrund der gleichzeitigen Analyse von Dutzenden oder Hunderten von Verbindungen und dem Fehlen der Notwendigkeit, teure Diagnosekits zu kaufen. Darüber hinaus hat das Labor die Möglichkeit, alle notwendigen Analysemethoden selbstständig zu entwickeln und ist nicht auf den Kit-Hersteller angewiesen.

Auswahl der richtigen Instrumentierungskonfiguration

Es gibt eine große Anzahl verschiedener Massenspektrometriemethoden und Arten von Massenspektrometern, die zur Lösung einer Vielzahl von Problemen entwickelt wurden – von der strukturellen Identifizierung komplexer Proteinmakromoleküle mit einem Gewicht von Hunderttausenden Dalton bis hin zur routinemäßigen quantitativen Hochdurchsatzanalyse kleiner Moleküle.

Für erfolgreiche Lösung Angesichts der Aufgabenstellung ist die Wahl des richtigen Gerätetyps eine der Hauptvoraussetzungen. Es gibt kein universelles Gerät, mit dem Sie die gesamte Bandbreite analytischer Probleme lösen können. Daher ist ein Gerät zur Lösung des Problems der Identifizierung von Mikroorganismen nicht in der Lage, eine quantitative Analyse kleiner Moleküle durchzuführen. Umgekehrt. Der Punkt ist, dass trotz gemeinsamen Namen, das sind völlig unterschiedliche Geräte, die nach unterschiedlichen physikalischen Prinzipien arbeiten. Im ersten Fall handelt es sich um ein Flugzeitmassenspektrometer mit einer Laserionisationsquelle – MALDI-TOF, und im zweiten Fall um einen Dreifachquadrupol mit Elektrospray-Ionisation – HPLC-MSMS.

Der zweitwichtigste Parameter ist die Wahl der richtigen Systemkonfiguration. Es gibt mehrere große Hersteller von Massenspektrometriegeräten. Die Geräte jedes Herstellers haben nicht nur ihre eigenen Stärken, sondern auch Schwächen, über die sie meist lieber schweigen. Jeder Hersteller produziert seine eigene Gerätelinie. Die Kosten für einen Analysekomplex liegen zwischen 100.000 und 1.000.000 Dollar oder mehr. Die Wahl des optimalen Herstellers und der richtigen Gerätekonfiguration spart nicht nur erhebliche finanzielle Ressourcen, sondern löst die Aufgabe auch effektiver. Leider gibt es viele Beispiele, bei denen Laborgeräte ohne Berücksichtigung dieser Faktoren durchgeführt wurden. Das Ergebnis sind ungenutzte Geräte und Geldverschwendung.

Der dritte Faktor, der den erfolgreichen Betrieb eines Labors bestimmt, ist das Personal. Der Betrieb von Massenspektrometern erfordert hochqualifiziertes Personal. Leider gibt es in Russland an keiner einzigen Universität einen Kurs in moderner praktischer Massenspektrometrie, insbesondere in Bezug auf klinische Anwendungen, und die Aufgaben der Ausbildung des Personals in jedem Labor müssen selbst gelöst werden. Natürlich reichen 2-3 Tage Einführungsschulung durch den Hersteller nach der Markteinführung des Gerätes absolut nicht aus, um die Grundlagen der Methode zu verstehen und sich Kenntnisse im Umgang mit dem Gerät anzueignen.

Der vierte Faktor ist der Mangel an vorgefertigten Analysemethoden. Jedes Labor hat seine eigenen vorrangigen Aufgaben, für die es notwendig ist, eigene Methoden zu entwickeln. Dies kann von einer Person durchgeführt werden, die über mindestens 2-3 Jahre Erfahrung im Umgang mit dem Gerät verfügt. Hersteller bieten manchmal ein oder zwei allgemeine Methoden mit Empfehlungscharakter an, passen diese jedoch nicht an die spezifischen Aufgaben des Labors an.

IN BioPharmExpert LLC Wir beschäftigen Spezialisten mit langjähriger Erfahrung in der Arbeit an verschiedenen Arten von Massenspektrometern sowie in der Entwicklung von Methoden und der Durchführung von Hochdurchsatzanalysen. Deshalb bieten wir folgende Dienstleistungen an:

1. Auswahl der optimalen Gerätekonfiguration für die spezifischen Aufgaben des Kunden.
2. Kauf, Lieferung und Einführung von Geräten führender Hersteller von Tandem-Massenspektrometern. Schrittweise Schulung des Personals innerhalb eines Jahres ab dem Datum der Geräteeinführung.
3. Eine Reihe vorgefertigter Techniken und Datenbanken zur Lösung grundlegender klinischer Probleme.
4. Entwicklung von Analysemethoden und Lösung spezifischer Probleme des Kunden in seinem Labor unter Einbindung seiner Mitarbeiter.
5. Methodische Unterstützung in allen Phasen der Arbeit.