Главная функция Fab-фрагмента – связывание антигена, так как в его состав входит активный антигенсвязывающий центр молекулы иммуноглобулина, сформированный VH и VL-доменами тяжелой и легкой цепей.
Функции Fс-фрагмента:
· Разные классы иммуноглобулинов отличаются между собой по строению Fс-фрагментов. Эти различия могут касаться как количества СН-доменов, входящих в состав Fc-фрагментов, так и их аминокислотного состава (могут быть дополнительные домены, например, СН 4 у IgM и IgE). Благодаря различиям в строении Fc-фрагментов, классы иммуноглобулинов различаются и по функциям. Структура различных классов и подклассов иммуноглобулинов представлена на рис. 22.
· С помощью Fс-фрагментов происходит полимеризация молекул иммуноглобулинов. Например, секреторный IgA образует димеры и тримеры, сывороточный IgМ является пентамером.
· В Fc-фрагментах IgМ, IgG 1 и IgG 3 при связывании с антигеном происходит структурное изменение, в результате которого в области СН 2 -домена возникает активный участок, связывающий первый компонент системы комплемента, поэтому эти классы иммуноглобулинов у человека вызывают активацию системы комплемента по классическому пути .
· С помощью Fс-фрагментов молекулы иммуноглобулинов встраиваются в плазматическую мембрану В-лимфоцитов и являются антигенраспознающими рецепторами .
· На поверхности многих клеток организма имеются Fс-рецепторы к разным классам иммуноглобулинов . Если к этим рецепторам прикрепляются соответствующие иммуноглобулины или иммунные комплексы, в состав которых входят эти иммуноглобулины, то через эти рецепторы может происходить активация или подавление функций соответствующих клеток . Например:
· На клетках трофобласта плаценты имеются Fc-рецепторы только к IgG. Прикрепляясь к этим рецепторам, IgG включает механизм активного транспорта и переносится через плаценту. Поэтому от матери к ребенку трансплацентарно передается только IgG, обеспечивая пассивный иммунитет новорожденных. Для других классов иммуноглобулинов таких рецепторов на клетках плаценты нет, поэтому они через неё не проникают.
· На поверхности макрофагов и нейтрофилов имеются Fc-рецепторы к IgG. Если к этим рецепторам прикрепляются циркулирующие иммунные комплексы, в состав которых входит IgG, то через Fс-рецепторы стимулируется фагоцитоз иммунного комплекса.
Рисунок 22. Структура разных классов иммуноглобулинов
· На поверхности тучных клеток и базофилов имеются Fc-рецепторы к IgE. Молекулы цитофильного IgE присоединяются своими Fc-фрагментами к Fc-рецепторам тучных клеток и базофилов. В этом заключается суть процесса сенсибилизации организма при атопической аллергии на клеточном уровне. При повторном контакте с аллергеном он связывается с Fab-фрагментами IgE, фиксированного на поверхности клеток-мишеней. В результате связывания антиген-антитело в молекуле IgE происходит энергетическая и структурная перестройка, которая через шарнирный участок распространяется и на Fc-фрагмент, вследствие чего через Fc-рецептор клетка-мишень активируется и происходит ее дегрануляция, т.е. высвобождение гранул с биологически активными веществами (гистамин, брадикинин и др.), которые, действуя на окружающие клетки, вызывают собственно аллергическую реакцию.
Антитела (Ат) - эффекторные молекулы гуморального иммунитета. Синтез антител запускают Аг, поступающие в организм извне (при инфекциях, вакцинации, действии ксенобиотиков) или образующиеся эндогенно. Как правило, AT специфически взаимодействует с комплементарным Аг. Существуют, однако, антитела, взаимодействующие с Аг-детерминантами, общими для различных Аг. Такие антитела известны как перекрёстнореагирующие, или гетероспецифичные.
Антитела существуют в миллионах разновидностей, и каждая молекула имеет уникальный участок связывания Аг-детерминанты. В большинстве случаев антитела представлены сывороточными гликопротеинами , мигрирующими в составе медленной фракции гамма-глобулинов при электрофорезе белков сыворотки крови. Поэтому для обозначения сывороточной фракции AT иногда применяют термин «гамма-глобулины ».
Антитела также называют «иммуноглобулины» . Антитела (Ат) образуют одну из основных фракций белков крови, составляя 20% массы общего белка плазмы. AT устойчивы к действию слабых кислот и щелочей, а также к нагреванию до 60 °С.
Структурная единица AT - мономер - молекула цилиндрической формы, состоящая из двух идентичных тяжёлых Н-цепей [от англ. heavy, тяжёлый] и двух идентичных лёгких L-цепей [от англ. light лёгкий]. Тяжёлые и лёгкие цепи Ig состоят из аминокислотных остатков и соединены дисульфидными (-S-S-) связями. В цепях различают вариабельную область, или V-область [от англ. various, разный], и константную область, или С-область [от англ. constant, постоянный]. V-область у разных AT варьирует. V-области L- и Н-цепей образуют Аг-связывающий центр (активный центр AT, паратоп), или Fab-фрагмент [от англ. fragment фрагмент, + antigen binding, связывающий Аг]. Константная область молекулы называется Fc-фрагмент [от англ. fragment crystallizable, фрагмент кристализации].
В месте соединения Fab- и Fc-фрагментов расположена шарнирная область, позволяющая Аг-связывающим фрагментам разворачиваться для более тесного контакта с Аг.
Область молекулы антител (Fab) определяет антигенную специфичность, а Fc осуществляет эффекторные функции.
Fab-фрагменты антитела взаимодействуют с антигенными детерминантами. Аг-связывающий центр комплементарен эпитопу Аг (принцип ключ-замок). Связывание Аг с AT нековалентно и обратимо. Аффинность (сродство) Аг к антителу определяется физико-химическими свойствами взаимодействующих молекул и соотношением концентраций связанных и свободных Аг и антител. На сродство влияют пространственное соответствие взаимодействующих участков молекул, электростатические, гидрофобные взаимодействия и силы Ван дер Ваальса.
Авидность - интегральная характеристика силы связи между Аг и AT, учитывающая взаимодействие всех активных центров с эпитопами Аг.
Валентность антитела - число активных (Аг-связывающих) центров антитела. Молекула полного Ig как минимум двухвалентна. Такие антитела известны как полные антитела; мономеры с меньшей валентностью - неполные антитела.
Полные антитела (в частности, IgM, IgG) вызывают агрегацию Аг, видимую невооружённым глазом (например, РА бактерий).
Неполные антитела содержат один Аг-связывающий центр и, поэтому, одновалентны (например, антитела, вырабатываемые при бруцеллёзе). Второй Аг-связывающий центр у подобных Ig экранирован различными структурами либо обладает низкой авидностью.
Неполные антитела функционально дефектны, так как не способны агрегировать Аг. Неполные AT могут связывать эпитопы Аг, препятствуя контакту с ними полных антител; поэтому их также называют блокирующими антителами .
Fc-фрагмент антитела
Константные участки тяжёлых цепей определяют характер взаимодействий антитела с клетками и молекулами иммунной системы, в частности специфичность связывания молекулы Ig с клетками-эффекторами (например, фагоцитами, тучными клетками), несущими на своей поверхности рецепторы к Fc-фрагменту.
Fc-фрагмент определяет также эффекторные функции антитела (например, активацию комплемента). Для реализации этих свойств сразу после связывания Аг Fab-фрагментами происходят конформационные изменения структуры Fc-фрагментов. Пространственно изменённые Fc-фрагменты распознают фагоциты, именно они способствуют фиксации С1а-компонента комплемента и запуску комплементарного каскада по классическому пути. В противном случае ни клетки, ни эффекторные молекулы были бы не в состоянии отличить интактные AT или антитела, связавшие Аг.
Взаимодействие антител с антигеном включает специфическую и неспецифическую фазы.
Специфическая фаза протекает быстро и представляет специфическое взаимодействие активного центра с Аг.
Неспецифическая фаза протекает медленнее, зависит от присутствия электролитов и свойств Аг. Корпускулярные Аг агрегируются в крупнодисперсные конгломераты и выпадают в осадок (феномен агглютинации).
Растворимые Аг образуют мелкодисперсные конгломераты (феномен преципитации), проявляющиеся помутнением раствора или образованием колец преципитации либо зон преципитации в гелях.
Константные участки лёгких цепей бывают двух типов - каппа (к) и ламбда; константные участи тяжёлых цепей представлены пятью основными формами - мю (р), гамма (у), дельта (8), альфа (а) и эпсилон (е). Каждая из них ассоциирована с отдельным классом Ig. Выделяют 5 классов AT: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM .
Молекулы IgG, IgD и IgE представлены мономерами, IgM - пентамерами; молекулы IgA в сыворотке крови - мономеры, а в экскретируемых жидкостях (слёзная жидкость, слюна, секреты слизистых оболочек) - димеры.
IgM синтезируются при первичном попадании Аг в организм. Пик образования приходится на 4-5-е сутки с последующим снижением титра. Образование IgM к некоторым Аг (например, жгутиковым Аг бактерий) осуществляется постоянно. К IgM относят значительную часть AT, вырабатывающихся к Аг грамотрицательных бактерий.
Наличие IgM к Аг конкретного возбудителя указывает на острый инфекционный процесс.
Молекула IgM - пентамер; пять субъединиц соединены J-цепью [от англ. joining, связывающий], в результате чего молекула IgM приобретает 10 Аг-связывающих участков.
Молекулы IgM опсонизируют, агглютинируют, преципитируют и лизируют содержащие Аг структуры, а также активируют систему комплемента по классическому пути (для комплементзависимого лизиса бактерии достаточно одной молекулы IgM).
Иммуноглобулин G (IgG) - основной класс AT (до 75% всех Ig), защищающий организм от бактерий, вирусов и токсинов. После первичного контакта с Аг синтез IgM обычно сменяется образованием IgG.
Максимальные титры IgG при первичном ответе наблюдают на 6-8-е сутки. Обнаружение высоких титров IgG к Аг конкретного возбудителя указывает на то, что организм находится на стадии реконвалесценции или конкретное заболевание перенесено недавно. В особо больших количествах IgG синтезируется при вторичном ответе.
IgG представлены 4 подклассами: IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4; их относительное содержание (в %) составляет соответственно 66-70, 23, 7-8 и 2-4. IgG непосредственно участвуют в реакциях иммунного цитолиза, реакциях нейтрализации, а также усиливают фагоцитоз, действуя как опсонины и связывая рецепторы Fc-фрагмента в мембране фагоцитирующих клеток (в результате этого фагоциты эффективнее поглощают и лизируют микроорганизмы).
Только IgG способны проникать через плаценту, что обеспечивает формирование у плода пассивного иммунитета.
Иммуноглобулины А (IgA) циркулируют в сыворотке крови (составляет 15-20% от всех Ig), а также секретируются на поверхность эпителия. Присутствуют в слюне, слёзной жидкости, молоке и на поверхности слизистых оболочек.
AT класса IgА усиливают защитные свойства слизистых оболочек пищеварительного тракта, дыхательных, половых и мочевыделительных путей. В сыворотке крови IgA циркулируют в виде двухвалентных мономеров; в секретируемых жидкостях преобладают четырёхвалентные димеры, содержащие одну J-цепь и дополнительную полипептидную молекулу (синтезируемый эпителиальными клетками секреторный компонент).
Эта молекула присоединяется к мономерам IgA в ходе их транспорта через эпителиальные клетки на поверхность слизистых оболочек. Секреторный компонент участвует не только в связывании молекул IgA, но обеспечивает их внутриклеточный транспорт и выделение на поверхность слизистых, а также защищает IgA от переваривания протеолитическими ферментами.
Молекулы IgA участвуют в реакциях нейтрализации и агглютинации возбудителей. Кроме того, после образования комплекса Аг-АТ они участвуют в активации комплемента по альтернативному пути.
Иммуноглобулин Е (IgE) специфически взаимодействуют с тучными клетками и базофильными лейкоцитами, содержащими многочисленные гранулы с БАВ. Их выделение из клетки (дегрануляция) вызывает резкое расширение просвета венул и увеличение проницаемости их стенки. Подобную картину можно наблюдать при аллергических реакциях (например, бронхиальной астме, аллергическом рините, крапивнице).
Аг-связывающие Fab-фрагменты молекулы IgE специфически взаимодействуют с Аг, попавшим в организм. Сформированный иммунный комплекс взаимодействует с рецепторами Fc-фрагментов IgE, встроенных в клеточную мембрану базофила или тучной клетки. Это взаимодействие и является сигналом для дегрануляции с высвобождением гистамина и других БАВ и развёртыванием острой аллергической реакции.
Изобретение относится к области медицины, в частности к иммунологии, и может применяться для нейтрализации TNF y пациента, нуждающегося в такой нейтрализации. Пациенту вводят IgG - Fab-фрагмент, обладающий реактивностью по отношению к TNF.Указанный Fab-фрагмент происходит от поликлонального IgG. Причем пациент страдает септическим шоком или симптомами септического шока. Для нейтрализации TNF также используют фармацевтическую композицию, которая содержит IgG - Fab-фрагмент, обладающий реактивностью по отношению к TNF и физиологически приемлемый носитель, а Fab-фрагмент происходит от поликлонального IgG. Способ и композиция обеспечивают повышение эффективности лечения симптомов септического шока. 4 с. и 5 з.п. ф-лы, 3 табл., 9 ил.
Настоящее изобретение относится к использованию Fab-фрагментов иммуноглобулина в терапии. Антитела образуются как часть иммунного ответа организма на попадание в него микроорганизмов или чужеродных молекул. Эти антитела представляют собой иммуноглобулин (Ig) и широко используются в клинической практике для диагностики, наблюдения, и лечения все возрастающего числа заболеваний. Основная единица, из которой образуются все молекулы антител, была обнаружена Портером (1959) Biochem J. 73, 119-126, с использованием протеолитических ферментов. Одним из наиболее важных классов иммуноглобулинов, а именно IgG, состоит из двух тяжелых и двух легких цепей, причем тяжелые цепи связаны в своей шарнирной области дисульфидными связями. Расщепление этих связей папаином приводит к образованию двух антиген-связывающих фрагментов (Fab), и и одного кристаллизующегося фрагмента (Fc), как показано на фиг. 1. Расщепление пепсином ниже шарнирной области приводит к образованию немного более мелкого Fc-фрагмента, и одного F(ab") 2 -фрагмента с двумя сайтами связывания, как показано на фиг. 1. Каждый Fab-фрагмент содержит легкую цепь и часть тяжелой цепи, и включает в себя последовательности, ответственные за специфическое связывание с микроорганизмом и чужеродной макромолекулой. Fc состоит из оставшихся частей двух тяжелых цепей, и представляет собой участок, с которым могут связываться комплемент, макрофаги, и полиморфно-ядерные лейкоциты. Две тяжелые цепи (но не легкие цепи) для каждого класса антител, т. е. IgG, IgM, IgA и IgE, являются различными. Из общего количества всех иммуноглобулинов, присутствующих в кровотоке, наибольшая доля приходится на IgG. Он состоит из одной основной иммуноглобулиновой единицы, и обладает характерной для него высокой степенью сродства к своему специфическому антигену. Структура антител и их функции более подробно раскрыты Roitt (1991) Essential Immunology,. 7th Edition, Blackwell Scientific Publications, Oxford. Вредное действие микробных патогенов может быть обусловлено высвобождением растворимых токсинов. Такими токсинами являются нейрогенные экзотоксины, высвобождаемые дифтерийной и столбнячной палочками, и различные эндотоксины, такие как липополисахариды (LPS), выделяемые клеточными стенками грам-отрицательных бактерий, и пептидоглиганы, выделяемые грам-положительными микроорганизмами. В 1890 году, фон Беринг показал, что экзогенные антитела к растворимым антигенам обладают терапевтическим действием, так, например, смертность детей от дифтерии снижалась благодаря системному введению сыворотки, полученной от лошади, гипериммунизированной дифтерийным токсоидом. Аналогичный эффект был получен и для пациентов, страдающих столбняком. В 1894 году, Кальметт (Calmette) и др. применили пассивную иммунизацию к пациентам с интоксикацией, вызванной укусом змей. В развитии синдрома септического шока принимают участие инициаторы (такие, как липополисахариды, LPS), медиаторы (включая, TNF, 1L-1 и 1L-6), и эффекторы на клеточном уровне (например, (окись азота)-синтаза в эндотелиальных клетках). Все инициаторы и медиаторы являются потенциальными антигенами, и антитела против этих макромолекул могут быть использованы для предупреждения и лечения септического шока. Некоторыми исследователями, с различной степенью успеха, были использованы поликлональные (PcAb) или моноклонельные (McAb) антитела, направленные против TNF. В то же самое время было показано, что PcAb против TNF могут предупреждать летальное действие этого цитокина (Beutler et al., (1985) Science 229, 869-871) у BALB/C-мышей. Tracey и его коллеги ((1987) Nature 330, 662-664) показали, что McAb против TNF, введенные за 1 час до контрольного заражения повианов, обеспечивают частичную защиту от поражения органов, а введение этих антител за два часа до контрольного заражения обеспечивает более полную защиту. Другими словами, моноклональные антитела (McAb) против TNF были использованы профилактически. Несколько групп исследователей продуцировали, в основном, у кроликов поликлональные антитела (PcAb) к LPS и к TNF, и продемонстрировали их эффективность против септического шока на моделях животных. Кроме того, PcAb к LPS также индуцировались у добровольцев, а затем успешно использовались (Ziegler et al., 1982) New Engl. J. Med. 307, 1225-1230). Хотя использование человеческих антител позволяет избежать риска возникновения аллергических реакций, однако такое использование не получило широкого распространения из-за этических, материально-технических, и других соображений, включая риск возможного заражения вирусной инфекцией (ВИЧ и гепатит). Поэтому большинство исследователей сконцентрировало свои усилия на продуцирование McAb. McAb имеют много преимуществ, в числе которых являются, например, их гомогенность и относительная простота их окончательной обработки, в основном, с помощью аффинной хроматографии с использованием белка A или белка G для отделения антител от других белков. Однако никто из исследователей, участвующих в разработке способов лечения септического шока, не получил и не использовал специфические Fab-фрагменты. Кроме того, никто из исследователей не продемонстрировал использование Fab-фрагментов против TNF для лечения людей, страдающих септическим шоком с явно выраженными клиническими симптомами, характерными для этого заболевания. Краткое описание изобретения
Авторами настоящей заявки было продемонстрировано, что введение Fab-фрагмента, обладающего реактивностью против TNF, оказывает положительное воздействие на пациентов, страдающих симптомами "септический шок". Кроме того, авторами настоящей заявки было неожиданно обнаружено, что Fab-фрагменты, происходящие от поликлональных антител, направленных против TNF, являются более эффективными для снижения действия TNF, чем интактный иммуноглобулин IgG против TNF, как подробно описано в примерах. Таким образом, в одном из своих аспектов, настоящее изобретение относится к способу нейтрализации действия TNF у пациентов, нуждающихся в такой нейтрализации, который предусматривает введение этому пациенту Fab-фрагмента, являющегося реакционноспособным по отношению к TNF.
Указанные пациенты обычно страдают от септического шока или от симптомов септического шока. Таким образом, в другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу предупреждения или ослабления септического шока или его симптомов у пациента, предусматривающему введение пациенту IgG-Fab-фрагментов, являющихся реакционноспособными по отношению к TNF.
В другом аспекте, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей IgG-Fab-фрагменты, являющиеся реактивными по отношению к TNF, и физиологически приемлемый носитель. В общих чертах, IgG-Fab-фрагменты могут быть использованы всякий раз, когда возникает необходимость в нейтрализации TNF у пациентов. Водимую дозу определяют в зависимости от веса пациента и тяжести состояния, но, в основном, специфический Fab-фрагмент против TNF может быть введен взрослым пациентам в количестве 200-2000 мг в течение 2-3 дней. В основном, если Fab-фрагмент производит от поликлональной антисыворотки и не является аффинно-очищенным, то может быть введено 120 мг/кг суммарного Fab, который содержит 20 мг/кг специфического Fab против TNF.
Предпочтительно, чтобы Fab-фрагмент был, в основном, чистым и апирогенным. Fab-фрагмент может быть, в основном, очищен с использованием хроматографической техники, такой как катионообменная хроматография, или аффинная хроматография. Предпочтительно, если Fab-фрагмент является аффинно очищенным. IgG-Fab-фрагменты настоящего изобретения или их композиции могут быть введены любым стандартным системным методом, включая парентеральную (например, внутривенную, подкожную, или внутримышечную) инъекцию. Лечение может предусматривать введение разовой дозы или нескольких разделенных доз в течение определенного периода времени. Хотя IgG-Fab-фрагмент настоящего изобретения может быть введен отдельно, однако, предпочтительно, чтобы этот фрагмент присутствовал в фармацевтической композиции в сочетании с одним или несколькими приемлемыми носителями. Носитель должен быть "приемлемым" в том смысле, что он должен быть совместимым с Fab-фрагментом, и не оказывать неблагоприятного воздействия на реципиента. Композиции, содержащие IgG-Fab-фрагменты, могут быть изготовлены в виде унифицированной лекарственной формы с использованием любых методов, которые обычно используются в фармацевтической практике. Такие методы включают в себя стадия смешивания IgG-Fab-фрагмента с носителем, состоящим из одного или нескольких вспомогательных ингредиентов. В основном, указанные композиции получают путем равномерного и тщательного размешивания активного ингредиента с жидкими носителями. Композиции, предназначенные для патентерального введения, изготавливают в виде водных или безводных стерильных растворов для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты, и растворенные вещества для придания композиции изотоничности с кровью реципиента, и в виде водных и безводных стерильных суспензий, которые могут содержать суспендирующие агенты и загустители. Эти композиции могут быть изготовлены в упаковках, рассчитанных на один прием, или в упаковках для многократного приема, например, в виде герметичных ампул и флаконов, и кроме того, они могут храниться в лиофилизированном состоянии, которое требует лишь добавления стерильного жидкого носителя, например, воды для инъекций, перед их непосредственным использованием. Таким образом могут быть приготовлены инъецируемые растворы для немедленного приема. Предпочтительными унифицированными лекарственными композициями являются композиции, содержащие суточную дозу или единицу, дневную субдозу или ее соответствующую фракцию, активного ингредиента. Ниже приводится описание настоящего изобретения, проиллюстрированное соответствующими примерами и чертежами, где:
На фиг. 1 схематически представлена структура молекулы антитела. На фиг. 2 показано воздействие антитела против TNF на давление в легочной артерии и лимфоток у овцы. На фиг. 3 показано воздействие Fab-фрагментов против TNF на липополисахарид-индуцированную смертность у мышей. На фиг. 4 показано влияние конкурентного введения IgG или Fab-фрагментов против TNF и TNF на клетки L929. На фиг. 5 показан эффект введения IgG или Fab-фрагментов против TNF через два часа после TNF-обработки. На фиг. 6. показан эффект введения IgG или Fab-фрагментов против TNF через 4 часа после TNF-обработки. На фиг. 7 показано влияние Fab-фрагмента против TNF, или физиологического раствора на температуру пациентов, которые имели до начала эксперимента нормальную температуру. На фиг. 8 показано влияние Fab-фрагмента против TNF, или физиологического раствора на температуру пациентов, которые имели до начала эксперимента повышенную температуру. На фиг. 9 показаны максимальные уровни TNF у пациентов, которым были введены физиологический раствор, контрольный Fab-фрагмент, или Fab-фрагмент против TNF.
Пример 1. Получение TNF-иммуногена для иммунизации овец
Процедура
Получение сосудов, содержащих активный TNF-иммуноген
Сосуды должны быть новыми, не должны содержать пыли, и должны быть обработаны сиалинирующей жидкостью за 48 часов до эксперимента в целях предупреждения адгезии иммуногена к стенкам сосудов. Сиалинирующий раствор необходимо заменять свежим раствором каждые 24 часа. Сиалинирование осуществляют следующим образом:
A) Сосуды ставят на металлический поднос в вытяжной шкаф
B) Сиалинизирующий раствор приготавливают в соответствии с инструкциями производителей. Затем раствор разводят до получения 0,1%-ного раствора. При этом 0,2%-ный раствор получают при использовании 99 частей воды на 1 часть AQUASIL (Торговая марка). Раствор постоянно размешивают. Сосуды должны быть наполнены раствором до краев. После этого проводят осушку воздухом по крайней мере в течение 24 часов. После хранения при 4 o C, TNF удаляют, а раствор оставляют для уравновешивания при комнатной температуре в течение по крайней мере 30 минут. Полное количество TNF для разовой ежемесячной иммунизации все группы овец отвешивают в стерильной 150-миллиметровой колбе Sterilin (торговая марка) с использованием весов. Необходимые расчеты проводят как описано ниже в главе "Вычисления, необходимые для получения иммуногена". В этих расчетах, количество иммуногена обозначается E. Любой избыток полученного иммуногена может быть сохранен, а затем использован в последующих экспериментах. Затем иммуноген растворяют в 0,9%-ном физиологическом растворе. После этого раствор размешивают при непрерывном вращении в течение по крайней мере 30 минут. Количество используемого физиологического раствора обозначали F (см. ниже). Аликвоты полученного раствора иммуногена распределяли по сосудам с использованием стерильных пипеток и устройства Pipetteman (торговая марка). Вычисления, проводимые при получении иммуногена
Каждый сосуд должен содержать количество иммуногена, достаточное для иммунизации 3 овец. Затем это полное количество иммуногена (A) делят на три и округляют до следующего значения целого числа. A/3 = B, например, 49/3 = 16,33, а после округления 17
Следовательно, количество отвешиваемого TNF составляет 3B, умноженное на количество иммуногена, требуемое для одной овцы (C). (3B)C = D, например, если иммунизирующая доза для одной овцы составляет 80 мкг, то (317)80 = 4080 мкг = 4,08 мг
Причем при взвешивании иммуногена необходимо учитывать содержание соли, которое может варьироваться от партии к партии. (D/3 TNF в используемом материале)100 = E
Например, если используемый материал содержит 95% соли и соответственно 5% TNF, то (4,08/5)100 = 81,6 мг
Затем отвешенный иммуноген растворяют в соответствующем количестве 0,9%-ного физиологического раствора, которое вычисляют путем умножения количества используемых сосудов на 4. Каждый сосуд должен содержать 4 мл физиологического раствора. B4 = F, например, 174 = 68 мл
Пример 2. Схема иммунизации, взятия образцов и крови для получения овец, иммунизированных против TNF
В нижеприведенной Таблице I дана схема введения (в течение года, каждые две недели) иммунизирующей дозы, взятия крови, и обработки отдельных образцов или всех образцов для получения овец, иммунизированных против TNF.
Образцы брали от каждого животного до первичной иммунизации. Этот уровень определял фоновый уровень для каждой овцы. При этом были использованы следующие обозначения:
1: первичная иммунизация
R#: номер повторной иммунизации, проводимой после первичной иммунизации
Образец: 5-10 мл пробы крови, взятой от каждого животного для определения титра
Кровь: 10 мл взятой крови на 1 кг веса тела
IS: Отдельный образец для оценки продуктивности отдельного животного
P: Сбор крови от всех животных
Пример 3. Получение Fab-фрагментов против TNF из частично очищенных IgG
Овец иммунизировали в соответствии с вышеприведенной схемой иммунизации определенными количествами TNF, выбранными исходя из проведенных исследований реакции "доза-ответ", как описано в примерах 1 и 2. После получения адекватных уровней специфических антител в крови (по крайней мере 3 г/л), у овец, в условиях стерильности, брали кровь, которую собирали в стерильные и апирогенные стеклянные флаконы, свертывание крови ускоряли путем использования роллер-флаконов; эти флаконы центрифугировали, после чего путем аспирации в ламинарном боксе собирали сыворотку, эту сыворотку подвергали 0,2 мкм-фильтрации и оставляли на хранение при -20 o C. Для предупреждения бактериального и пирогенного загрязнения, продукт был подвергнут тщательному анализу. От различных животных собирали антисыворотки, и их иммуноглобулины осаждали при 25 o C сульфатом натрия в целях их отделения от многих других сывороточных белков, включая альбумин. Иммуноглобулины, которые представляют, в основном, антитела класса IgG, промывали стерильным сульфатом натрия, и ресуспендировали в физиологическом растворе. Гидролиз папаином: Следующая стадия представляет собой расщепление антител на Fab и Fc-фрагменты с использованием папаина, активированного цистеином и EDTA. Эту стадию осуществляют в условиях, обеспечивающих полную деградацию интактного IgG. Кристаллизующийся фрагмент Fc удаляли путем центрифугирования. Супернатант после гидролиза папаином и центрифугирования содержит: (1) специфический Fab-фрагмент, направленный против нужного растворимого антигена, (2) неспецифический Fab-фрагмент, направленный против различных других эпитопов, и не представляющий интереса для рассматриваемой терапии, (3) небольшие количества белка (включая альбумин) и другие примеси, и (4) неактивированный папаин. Аффинная хроматография
Аффинная очистка. Аффинную очистку Fab-фрагмента, направленного против фактора некроза опухоли человека (TNF), осуществляли с использованием среды, содержащей сшитую агарозу (Sepharose), с которой был связан rTNF (рекомбинантный человеческий TNF). Для связывания rTNF со средой использовали изомочевинную связь. Изготовление матриц для аффинной хроматографии на колонке с агарозой rTNF
Материалы
Сефароза 4B, активированная бромцианом (Pharmacia, Uppsala Швеция)
RTNF (R/D Systems Minneapoplis, USA)
Корпус для афинных колонок BPG (Pharmacia)
Большая воронка из спеченного стекла
Колба Бюхнера
Вакуумный насос
Стеклянный стержень
Колба Налгена (Nalgen)
Буферы и растворы:
Все буферы должны быть стерильными и апирогенными (см. SOP 0,2, получение стерильных апирогенных буферов для терапевтического применения). Соляная кислота (1 мМ, 200 мг/г, охлажденная льдом)
Бикарбонат натрия (0,1 М, pH 8,3), содержащий хлорид натрия (0,5 М)
Этаноламин (1,0 М, pH 8,0)
Ацетат натрия (0,1 М, pH 4,0), содержащий хлорид натрия (0,5 М)
Процедура: При подготовке колонок, предназначеных для терапевтических целей, все процедуры должны проводиться в ламинарном потоке в условиях класса 100, а все оборудование должно быть стерильным и апирогенным. Набухание и промывка геля: необходимое количесвто лиофилизированного порошка Сефарозы отвешивали в пластиковый флакон Налгена, и суспендировали в HCl (охлажденном льдом). Затем набухший сразу после этого гель промывали в течение 15 минут на фильтре из спеченного стекла тем же самым раствором (200 мл/г геля). Раствор добавляли в нескольких аликвотах, и после добавления последней аликвоты, гель осушали до тех пор, пока на его поверхности не появлялись трещины. Связывание лиганда: TNF лиганд (5 мг/г используемого геля) растворяли в натрийбикарбонатном буфере (0,1 М, pH 8,3, 7 мг/г используемого геля) в пластиковых флаконах Налгена. После растворения брали аликвоты (0,25% от полного количества), и добавляли осушенный воздухом гель, при этом необходимо следить за тем, чтобы лигандный раствор не выплескивался из флакона. Затем полученную смесь подвергали непрерывному вращению в течение ночи при 4 o C. Блокирование активных групп на геле: после процедуры связывания, проводимой в течение ночи, гель переносили обратно на воронку из спеченного стекла, лигандный раствор отсасывали и собирали. Затем гель промывали 200 миллилитрами этаноламина. Все промывки собирали. После этого гель переносили во флаконы Налгена, содержащего этаноламин (1,0 М, pH 8,0), и смесь вращали в течение ночи, как описано выше. Промывка геля: блокированный гель переносили на воронку из спеченного стекла, после чего этаноломиновый раствор отсасывали и собирали. Затем гель промывали буфером для связывания (бикарбонатом), после этого ацетатным буфером, а затем снова буфером для связывания. Все промывки собирали. Затем гель может быть перенесен и упакован внутри колонки, после чего он моет быть тщательно промыт физиологическим раствором (0,9%). Эффективность связывания определяли путем измерения количества белка в промывках с последующим сравнением этого количества с аликвотой исходного лигандного раствора. После получения каждой партии материала и до первого добавления раствора полного Fab-гидролизата, колонки подвергали санитарной обработке. Fab-раствор вращали со скоростью потока 1 мл/мин в течение по крайней мере двух часов при 18 o C. Затем проводили десорбцию Fab против rTNF-токсина от носителя. Fab-фрагмент против овечьего rTNF, связанный с носителем, удаляли путем промывания колонки глицином (10 мМ, pH 2,5). Элюент собирали в цитратный буфер (0,6 М, pH 8,0: 2,5%-ная конечная концентрация), и оставляли на хранение в 2-литровых сборниках Налгена для одноразового использования. Затем брали образцы для QC-испытаний (GF-FPLC, pH, концентрация белка, стерильность, и LAL-тест) (QC - тест на качество, GF-гель-фильтрация, LAL-тест = лимулюс-тест: проба с лизатом амебоцитов -Прим. пер.)
Аффинные колонки уравновешивали с использованием фосфатного буфера (10 мМ, pH 7,3) до тех пор, пока pH элюента не становился равным приблизительно pH 5,5. Затем колонку уравновешивали физиологическим раствором (0,9%) для подготовки следующего цикла. Дополнительно или альтернативно может быть также использована катионообменная хроматография. Катионообменная хроматография
Полный Fab-раствор (в аммонийацетатном буфере) наносили на катионообменную колонку (BioRad MacroPrepS, в настоящий момент, хотя, в будущем, она может быть заменена на колонку с более слабым связыванием), где связывается большая часть (> 80%) Fab. Затем эту колонку, а следовательно, и связанные Fab промывали буфером (аммонийацетатным, pH 4,0) в объеме, составляющим три объема колонки, в целях санации продукта и удаления возможного загрязнения прионом или вирусами. После этой промывки, связанные полные Fab, элюировали путем промывания колонки буфером, содержащим хлорид натрия (0,5 М). Затем элюированные Fab подвергали ультрафильтрации, и промывали физиологическим раствором для удаления аммонийацетатного буфера, после чего, если это требовалось, концентрировали, и подавали насосом в стерильный полиэтиленовый мешок для переноса образцов. Этот мешок был непосредственно прикреплен к разливочной машине. Затем продукт окончательно фильтровали, разливали, окончательно расфасовывали, и лиофилизовали. Ионообменную колонку подвергали санитарной обработке между циклами с использованием гидроксида натрия (1,0 М), а затем снова уравновешивали аммонийацетатным буфером, после чего колонка была готова для проведения следующего цикла. Пример 4. Биологическое действие IgG против овечьих TNF
Результаты исследований, проведенных с использованием интактных и очищенных не аффинным способом антител, а также овечьей модели септического шока, показаны на фиг. 2. Эти антитела частично предупреждают повышение давления в легочной артерии и повышение лимфотока в легких, которое наблюдается в контрольной группе, не обработанной иммуноглобулинами IgG против TNF
Пример 5. Биологическое действие Fab-фрагментов против овечьих TNF у мышей
Результаты исследований, проведенных с использованием специфических Fab-фрагментов против овечьих TNF инъецированных мышам с летальной дозой эндотоксина, показаны на фиг. 3. 90% мышей, которым вводили эндотоксин, погибали на 4-й день. При введении мышам специфических Fab-фрагментов в концентрации 2 мг/кг и 20 мг/кг, этот процент снижался до 80% и 30%, соответственно. Пример 6. Сравнение защитного действия анти TNF-IgG и анти TNF-Fab-фрагментов, направленного против цитотоксичного действия TNF
Авторами настоящей заявки было проведено исследование защитного действия анти- TNF-IgG и анти-TNF Fab-фрагментов, направленного против цитотоксичности TNF , на клетках L929. При культивировании указанных выделенных клеток in vitro, добавление 10 нг/мл TNF к культуральной среде приводило к лизису клеток (о чем свидетельствовало снижение оптической плотности, как показано на фиг. 4). Одновременное добавление 100 мкг/мл IgG или Fab оказывало значительное защитное действие на клетки путем связывания антител с TNF и его нейтрализации, при этом защитное действие IgG лишь незначительно превышало защитное действие Fab. На фиг. 5, а особенно на фиг. 6 показаны совершенно неожиданные результаты. При добавлении антител через 2 или 4 часа после добавления TNF, защитное действие Fab-фрагментов значительно превышало защитное действие интактного IgG. Таким образом, совершенно очевидно, что усиление защитного действия обусловлено задержкой в добавлении специфических Fab-фрагментов. На основании этих данных можно сделать вывод, что Fab-фрагменты могут быть также использованы in vivo (т.е., введены пациенту) через 2 или 4 часа после увеличения уровней TNF во время септического шока. Пример 7. Клинические испытания использования анти TNF-Fab-фрагментов для предупреждения или ослабления реакции Джарича-Херксхеймера (JHP) после противомикробного лечения эпидемического возвратного тифа
После пандемии, охватившей страны Африки, Среднего востока и Европы в начале века, Эфиопия остается единственным регионом, где до сих пор имеют место вспышки эпидемий эпидемического возвратного тифа (LBRF). При некоторых эпидемиях, смертность людей, не получавших лечения, превышала 50%, однако, хотя противомикробное лечение является эффективным против спирохетоза, вызываемого Borrelia recurrentis и способствует предупреждению рецидивов заболевания, оно, тем не менее, ассоциируется с опасной для жизни реакцией Джарича-Херксхеймера (JHP), которая по своему проявлению напоминает классическую эндотоксиновую лихорадку. JHP связана с эксплозивным выбросом фактора некроза опухоли (TNF), 1L-6 и 1L-8. Было проведено испытание рандомизированным двойным слепым методом нового овечьего поликлонального Fab-антитела против TNF, которое было осуществлено в Аддис-Абебе с участием 49 пациентов, страдающих LBRF. За 30 минут до введения пенициллина, пациентам делали внутривенные вливания либо специфического анти-TNF-Fab (20 пациентам), либо контрольных Fab (19 пациентам), либо изотонического физиологического раствора (10 пациентам). JHP-реакции (которые клинически проявлялись в виде озноба) наблюдались у 10/20 пациентов, которым вводили специфические Fab, по сравнению с 26/29 пациентами группы контроля (p < 0,01). По сравнению с контрольными группами, у группы, получившей анти-TNF-Fаb, максимальное повышение температуры, частоты пульса, и систолического кровяного давления во время JHP был значительно более низкими (p < 0,01, < 0,0001, < 0,01, соответственно). Были проведены эксперименты, в которых участвовали пациенты, находящиеся в клинике Black Lion Hospital или в близлежащих клиниках, в том случае, если в их мазках крови обнаружили спирохету Borrelia
Критерии исключения из эксперимента
1. Дети моложе 12 лет
2. Беременные женщины
3. Пожилые люди (в возрасте более 60 лет) или сильно ослабленные с тяжелыми клиническими симптомами других острых заболеваний, например, таких как гипотензия, заметная желтуха, сильное истощение, и другие признаки недостаточного питания, склонность к сильному кровотечению, наличие сыпи при тифе, признаки активного туберкулеза легких, или легочной консолидации, состояние комы, менингит, сердечные респираторные заболевания или кома и "порхающий" тремор, эпилептические приступы, зафиксированные в истории болезни, и очаговые неврологические симптомы. 4. Пациенты с продолжительным сильным ознобом, гипотензией, или гипертермией, и другими симптомами спонтанной реакции ("кризис"). 5. Пациенты, принимающие другие антибиотики. К исследованиям и лечению допускались только те пациенты, которые давали свое информированное согласие на данные исследования и лечение. Исходная информация
История болезни, включая продолжительность и спектр симптомов, а также предварительное обследование физического состояния организма были зарегистрированы в соответствии со стандартной pro forma. Исследования
Пациенту в переднюю локтевую вену вводили политетрафтороэтиленовую канюлю, снабженную трехходовым вентилем, и пациента выдерживали на гепаринизированном физиологическом растворе. Брали пробы крови для анализа на микрогематоциты, на полное число лейкоцитов (WBC), число спирохет, уровни билирубина, ферментов печени, креатинин, или мочевины. Гемокультуру исследовали для обнаружения ассоциированных бактериальных инфекций (особенно тифозных). Как минимум 30 пациентов и как максимум 50 пациентов было произвольно отобрано для введения им внутривенно либо Fab-фрагментов овечьего поликлонального иммуноглобулина против TNF (ATNF-Fab), или идентичного на вид плацебо (контрольные Fab). 10 пациентов получали лишь изотонический физиологический раствор. Рано утром в день исследований, пациенты комфортно лежали в постели. Температуру измеряли с помощью электронного ректального термометра. Регистрировали также давление крови, частоту пульса и частоту дыхания. Обработка
Пациентам, чьи первоначальные ректальные температуры не изменялись более чем на 0,5 o C в течение 30 минут, вводили путем медленного (в течение 30 минут) внутривенного вливания 100 мл ATNF-Fab или контрольных Fab (содержимое сосудов, а именно 4 1,5 г лиофилизованного суммарных Fab, растворенных в 10 мл воды для инъекций, и разведенных до 100 мл изотоническим физиологическим раствором) или 100 мл изотонического физиологического раствора. Эта доза суммарных Fab-фрагментов иммуноглобулина соответствует дозе приблизительно 120 мг/кг, которая содержит около 20 мг специфических анти-TNF Fab. После завершения 30-минутного вливания, пациентам вводили внутримышечно (в переднюю мышцу бедра, разделенного на два участка, если это необходимо) стандартное противомикробное средство, а именно 600 000 ед. прокаинпенициллина. Oценка
Ректальные температуры, кровяное давление, частота пульса, частота дыхания и симптомы регистрировали в следующие интервалы времени (O = введение пенициллина): -60, -45, -30, 0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 150, 180 мин; 4,8 и 24 ч. Венозную кровь для подсчета числа спирохет, числа WBC (лейкоцитов), и числа цитокинов (TNF , 1L - 1 ; 1L - 8 и 1L - 6) брали в следующие интервалы времени: -30, 0, 60, 90 мин; 2, 4, 8 и 24 час. На протяжении всего эксперимента, пациентам разрешали пить. Сильная реакция JHP ожидалась через 60-90 минут после введения пенициллина. Материалы и методы
TNF-специфические овечьи полные Fab-фрагменты, используемые в клинических испытаниях, получали в соответствии со следующими процедурами:
Иммуноген
Антитоксин к TNF представлял собой Fab-фрагмент, продуцированный путем иммунизации овцы рекомбинантным чел. TNF (hr TNF),Hr TNF, продуцировали в E. coli путем экспрессии синтетического гена, сконструированного на основе известной кДНК, кодирующей чел. TNF (коммерчески доступный продукт, поставляемый Britich Biotechnology). Рекомбинантный белок, который имел молекулярную массу приблизительно 17,5 кДа, очищали до чистоты более чем 97%. Каждый пул иммуногена анализировали на чистоту, молекулярную массу, и цитотоксическую активность, а затем инъецировали овцам. Последний тест проводили путем анализа с использованием клеток L929 мышиной соединительной ткани. (i) Иммунизация
Группу из 10 овец иммунизировали путем подкожной инъекции на 6 участках. Иммунизацию проводили с убывающими дозами hr TNF, смешанного либо с полным, либо с неполным адъювантом Фрейнда, с последующими процедурами, осуществляемыми в соответствии со схемой иммунизации, описанной в примерах 1 и 2. Овец иммунизировали с интервалами времени в один месяц. (ii) Взятие образцов и проб крови
Через две недели после каждой иммунизации, у овец либо брали образцы для анализа (5 мл), либо брали пробы крови (500-700 мл) из яремной вены. Пробы крови переносили в стерильные апирогенные сосуды, оставляли для свертывания (в случае 5 - мл образца), или слегка вращали для стимуляции и более быстрого свертывания (в случае проб крови). Сгусток крови центрифугировали, а сыворотку (в виде супернатанта) отсасывали через стерилизующие (0,22 мкм) фильтры в гамма-облученные полиэтиленовые пакеты. (iii) Оценка образцов/проб крови
Через 6 и 22 недели после первичной иммунизации, для каждой овцы из группы оценивали титр антител с использованием простого твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). TNF связывали при высоком pH (9,6) с 96-луночным планшетом для твердофазного иммуноферментного анализа, и инкубировали с возрастающими разведениями сыворотки. hr TNF-специфические антитела в сыворотке связывались с планшетом, а несвязанные антитела затем удаляли путем промывания. Затем добавляли "второе" антитело, продуцированное в ослах и направленное против овечьих иммуноглобулинов, которое было конъюгировано с ферментом (пероксидазой хрена, HRP). В присутствии подходящего субстрата, HRP катализирует хромогенную реакцию, продукт которой является пропорциональным концентрации антитела в овечьей сыворотке. Затем образцы крови с титром более чем 1/30 000, объединяли с получением сывороточного пула от 10 овец. Овцы, которые не давали такого титра, были удалены из эксперимента. Отдельных овец не подвергали оценке после взятия образцов через 22 недели. (iv) Оценка сывороточного пула
Тесты на стерильность и содержание эндотоксинов осуществляли для каждого сывороточного пула, который, для использования его в изготовлении лекарственного средства, должен быть стерильным и содержать менее чем 1,25 э.ед/мл (э.ед. - эндотоксиновая единица - прим. пер.). Сбор пулов, и все последующие стадии осуществляли в чистом помещении в условиях класса 100. Каждый месяц пулы оценивали на титры с помощью ELISA, а также на концентрацию специфических антител с использованием мелкомасштабной аффинной очистки. Этот метод предусматривает пропускание иммунной сыворотки через аффинную колонку с небольшим количеством (1 г) hr TNFL-Сефарозы при селективной концентрации hr TNFL-специфических IgG. Эти IgG могут быть затем элюированы, и определена их концентрация. Для использования в изготовлении лекарственного средства, пулы должны содержать по крайней мере 2 г/л специфического антитела. (vi) Очистка иммуноглобулинов
Сывороточные фракции иммуноглобулина отделяли от других сывороточных белков, не представляющих терапевтической ценности, путем осаждения солью. Короче говоря, сульфат натрия (сорт USP 36%, 25 o C апирогенный и стерильный) в течение 15 минут при температуре 25 o C смешивали с объединенной сывороткой. Преципитат, полученный в результате этой процедуры, осаждали путем центрифугирования, а супернатант отсасывали. Затем осадок два раза промывали стерильным отфильтрованным раствором сульфата натрия (18%), концентрируя осадок после каждой промывки путем центрифугирования. Конечный осадок ресуспендировали в стерильном изотоническом (0,9%) солевом растворе, а затем фильтровали через стерильный фильтр (0,2 мкм). Анализ на стерильность и отсутствие эндотоксинов, а также титров проводили на данной стадии с использованием:
(I) теста на стерильность, USP (отсутствие 7-дневного роста)
(II) LAL-тест на эндотоксины
(III) Жидкостной экспресс-хроматографии белков методом гель-фильтрации (GF) (GF-FPLC)
(IV) Сравнения с необработанной сывороткой методом ELISA. Образцы, имеющие чистоту на 85% и титр на 85% больше, чем необработанная сыворотка, были использованы для продуцирования Fab. Концентрация иммуноглобулина на этой стадии составляла приблизительно 25 г/л, как показало измерение оптической плотности при 280 нм (с использованием коэффициента экстинкции 15,1% 280 нм для IgG). (V) Ферментный гидролиз
Fab-фрагменты иммуноглобулина получали путем инкубирования очищенного иммуноглобулина с растительным ферментом папаином, который сам по себе связывается с твердофазным носителем, что позволяет, после гидролиза, удалить фермент из гидролизной смеси. К IgG-препарату в присутствии восстановителя цистеина и EDTA (для сохранения ферментной активности) добавляли ферментную матрицу, и смесь оставляли на 24 часа при 37 o C для прохождения реакции гидролиза. По истечении этого времени, реакцию завершали путем центрифугирования смеси, в результате чего достигали две цели, а именно, удаляли из раствора иммобилизованный фермент, и избегали необходимости добавлять большие количества йодоацетамидного блокирующего агента. Затем раствор подвергали ультрафильтрации через 10 кДа-полисульфоновой ультрафильтр (содержащий предварительный фильтр из 0,45 мкм-стекловолокна), и промывали 10 объемами физиологического раствора (0,9%, стерильного и апирогенного) для удаления всех следовых количеств цистеина, EDTA, и любых Fc-фрагментов. Процедуры промывки обеспечивали уровни солевых примесей менее чем 2 млн.д. И наконец, стерильные апирогенные Fab-фрагменты фильтровали через стерилизующий 0,22 мкм-фильтр. На этой стадии брали образцы для оценки качества, а затем снова пропускали на GF-FPLC для контроля за эффективностью гидролиза, и после этого проводили также мелкомасштабную аффинную очистку для того, чтобы убедиться, что во время стадии гидролиза hr TNF-связывающая активность сохранилась на прежнем уровне. На этой стадии также осуществляли тест на стерильность и LAL-тест, и кроме того, проводили спектрофотометрическое определение концентрации. Концентрация Fab на этой стадии составляла приблизительно 60 г/л. В результате проведенных процедур, стерильные апирогенные (< 10 э.ед. /мл) образцы, которые указывали на полный гидролиз с образованием Fab (т.е. отсутствие интактного IgG), и которые по крайней мере на 85% по сравнению с исходной сывороткой сохраняли свою связующую способность, были готовы для заполнения флаконов. (vi) Заполнение флаконов
30-миллилитровые флаконы из нейтрального боросиликатного стекла наполняли 6,0 граммами Fab-раствора, и закрывали пробками из бутилкаучука. Затем сосуды замораживали при -70 o C в течение по крайней мере 30 минут, и переносили в стерильную сублимационную сушилку. В этой сушилке, сосуды выдерживали по крайней мере 48 часов, а затем герметично запаивали под вакуумом. Для инъекций, содержимое флаконов разводили водой (10 мл). На осушенных Fab проводили следующие тесты:
(a) тест на полную USP-стерильность, LAL-тест, и тест на пирогенный кроличий эндотоксин. (b) тест на концентрацию белка в восстановленном содержимом флакона с использованием метода Кьельдаля для определения азота. (c) тест на остаточную влагу,
(d) тест на чистоту с использованием FPLC путем гель-фильтрации,
(e) тест на определение hr TNF-нейтрализующей способности посредством анализа на цитотоксичность с использованием клеток L929. QC-тест (тест на качество)
Осуществляли следующие тесты:
Тест для оценки чистоты с помощью жидкостной экспресс-хроматографии (FPLC). Тест на стерильность. Лимулюс-тест (проба с лизатом амебоцитов) (LAL) на пироген. In vivo
Испытание кроликов на пироген
Испытания на острую токсичность, проводимые на мышах и морских свинках. Все партии были рандомизированы для использования в испытаниях двойным слепым методом. Подсчет лейкоцитов
Общее количество WBC подсчитывали с использованием гемоцитомера для подсчета клеток крови
Спирохеты
Мазки крови окрашивали по методу Райта, и исследовали с использованием оптического микроскопа. Цитокины
TNF,1L-1, 1L - 8 и 1L - 6 определяли с помощью иммуноанализа. Наборы для иммунорадиометрического анализа в целях подсчета цитокинов закупали у фирмы Medgenix Diagnostics SA, B -6220
Результаты:
1. Тяжелая клиническая реакция наблюдалась после введения пациенту физиологического раствора в качестве контроля. После того, как количество спирохет упало сразу после введения пенициллина (время = 0), дыхание пациента участилось, а температура повышалась, достигая иногда около 107 o F. На этой фазе пациент становился особенно уязвимым и может умереть от очень высокой температуры. 2. В эксперименте участвовали два пациента, которые имели нормальную температуру до начала эксперимента. Затем, у пациента, получившего физиологический раствор, наблюдалось повышение температуры, тогда, как у пациента, получившего анти-TNF-Fab, температура оставалась постоянной (фиг. 7). 3. В эксперименте участвовали также два пациента, которые имели высокие температуры к началу эксперимента. У пациента, получившего физиологический раствор, наблюдалось повышение температуры, тогда, как у пациента, получившего анти-TNF-Fab-температура вообще не повышалась и резко снижалась до нормальной (фиг. 8). 4. Исследование 59. Уровень цитокинов (1L-6, TNF, 1L-8 и 1L-1) у пациентов, получивших физиологический раствор, не изменялся в интервалы времени между - 30 час. и 0 (0 = введение пенициллина). У большинства пациентов, уровни цитокинов достигали максимума через 4 часа. Исследование 027. Уровни цитокинов у пациентов, получивших конт. Fab, не показали изменения в интервалы времени между - 30 и 0 (0 = введение пенициллина). Максимальный уровень наблюдался через 4 часа. Исследование 004. Уровни цитокинов у пациентов, получивших анти-TNF-Fab, резко снижались, по сравнению с контролем, в интервалы времени между - 30 час. и O (0 = введение пенициллина). Уровень других цитокинов оставался на приемлемом уровне, либо показывал значительно более низкий пик. На фиг. 9 показаны средние максимальные уровни TNF для пациентов, которым были введены анти-TNF-Fab или контрольные Fab, и для пациентов, которым был введен физиологический раствор. Кроме того, в Таблице 2 показаны эквивалентные данные для 1L - 8 и 1L - 6. В Таблице 3 показаны приступы реакции Джарича-Херксхеймера у пациентов, которым были введены контроль в виде физиологического раствора, либо Fab-контроль, либо анти-TNF-Fab. После введения анти-TNF-Fab не наблюдалось умеренных (2+) и сильных (3+) реакций. Клинические проявления JHR в виде озноба наблюдались у 10/20 пациентов, получавших анти-TNF-Fab по сравнению с 26/29 пациентами, которые получали контроль (p < 0,01) У анти-TNF-группы наблюдались значительно более низкие уровни повышения температуры, частоты пульса, и систолического кровяного давления во время JHR, чем у пациентов контрольной группы (p < 0,01, p < 0,0001, и p < 0,01, соответственно). Пример 8: Введение пациентам, получившим ОКТЗ-лечение, анти-TNF-Fab-фрагментов
ОКТЗ продуцировали из посевного материала родительский гибридомы (ATCC CP 8001 (Американская коллекция типовых культур, 12301, Parklawn Drive, Rockvilles, MD 20852-1776, США). Иммуноглобулин очищали из асцита, и приготавливали препараты. Схема лечения с использованием ОКТЗ описана в Ortho Study Group (1985) N. Engl. J. Med. 313, 337 - 342. Схема лечения с использованием ОКТЗ заключалась в следующем: пациенту, страдающему от реакции отторжения трупного трансплантата почки, инъецировали 5 мг ОКТЗ в течение 2 - 4 мин (i. v.) и эти инъекции повторяли ежедневно в течение 10 или 14 дней (всего вводили 50 или 70 мг мышиного моноклонального антитела). (Поликлональная антисыворотка против T-лимфоцитов (которая не является аффинно-очищенной) может быть также введена путем внутривенного вливания, но в гораздо более высокой дозе (100 - 300 мг) и в течение более длительного периода (а именно, около 6 час.). Такие вливания также должны проводиться ежедневно в течение 10-15 дней). Во время первой инъекции ОКТЗ, практически каждый пациент страдал от тяжелых признаков и симптомов, включая повышение температуры (по крайней мере у 90% пациентов), головные боли, тошноту и рвоту. Fab-фрагменты получали как описано в примерах 3 или 7. Эндогенные уровни TNF составляли 1 мкг/л или менее, и ограничивались областью внеклеточной жидкости (около 15 л). Для ослабления действия возрастающих уровней TNF и шоковых симптомов, индуцированных ОКТЗ, дозу 5 мг или 10 мг анти-TNF-Fab-фрагментов вводили в то же самое время, что и первую дозу ОКТЗ. Перед введением ОКТЗ и анти-TNF-Fab-фрагментов, пациентам вводили иммунодепрессанты, а именно, суточные дозы 1,0 мг/кг преднизолона и 142 мг/кг азатиоприна. После начала введения ОКТЗ и анти-TNF-Fab-фрагментов, пациентам вводили суточные дозы 0,6 мг/кг преднизолона и 30 мг/кг азатиоприна.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ нейтрализации TNF у пациента, нуждающегося в такой нейтрализации, отличающийся тем, что указанному пациенту вводят IgG - Fab-фрагмент, обладающий реактивностью по отношению к TNF, а указанный Fab-фрагмент происходит от поликлонального IgG. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный пациент страдает септическим шоком или имеет симптомы септического шока. 3. Способ предупреждения или частичного ослабления септического шока или симптомов септического шока у пациента, отличающийся тем, что указанному пациенту вводят IgG - Fab-фрагмент, обладающий реактивностью по отношению к TNF, а указанный фрагмент происходит от поликлонального IgG. 4. Способ по п.2 или 3, отличающийся тем, что симптомы септического шока вызваны введением моноклонального антитела ОКТЗ или функционального эквивалентного антитела. 5. Способ по п.2 или 3, отличающийся тем, что симптомы септического шока вызваны реакцией Джарича-Херксхеймера. 6. IgG - Fab-фрагмент, являющийся реактивным по отношению к TNF и предназначенный для использования его в медицине, происходит от поликлонального IgG. 7. IgG - Fab-фрагмент по п.6, отличающийся тем, что его применяют в изготовлении лекарственного средства для лечения пациентов, нуждающихся в нейтрализации TNF.8. IgG - Fab-фрагмент по п.7, отличающийся тем, что указанный пациент страдает септическим шоком или имеет симптомы септического шока. 9. Фармацевтическая композиция, содержащая IgG - Fab-фрагмент, облладающий реактивностью по отношению к TNF, и физиологически приемлемый носитель, где указанный Fab-фрагмент происходит от поликлонального IgG. Приоритет по пунктам.
Fab-фрагмент
(лат. fragmentum обломок, кусок)
часть молекулы иммуноглобулина, отщепляемая папаином и состоящая из легкой цепи и аминоконцевой половины тяжелой цепи; несет антидетерминанту .
1. Малая медицинская энциклопедия. - М.: Медицинская энциклопедия. 1991-96 гг. 2. Первая медицинская помощь. - М.: Большая Российская Энциклопедия. 1994 г. 3. Энциклопедический словарь медицинских терминов. - М.: Советская энциклопедия. - 1982-1984 гг .
Смотреть что такое "Fab-фрагмент" в других словарях:
- … Википедия
Эта статья об иммунологии. Об украинской поп рок группе см. Антитела (группа); о фильме см. Антитела (фильм, 2005). Антитела (иммуноглобулины, ИГ, Ig) это особый класс гликопротеинов, присутствующих на… … Википедия
- (Ig), группа близких по хим. природе и св вам глобулярных белков позвоночных животных и человека, к рые обычно обладают св вами антител, т. е. специфич. способностью соединяться с антигеном, к рый стимулирует их образование. И. продуцируются В… … Химическая энциклопедия
I Антитела белки сыворотки крови и других биологических жидкостей, которые синтезируются в ответ на введение антигена и обладают способностью специфически взаимодействовать с антигеном, вызвавшим их образование, или с изолированной детерминантной … Медицинская энциклопедия
Белки группы иммуноглобулинов, образующиеся в организме человека и теплокровных животных в ответ на попадание в него веществ (антигенов) и нейтрализующие их вредное действие. Основные формы проявления активности А. – агглютинация, преципитация,… … Словарь микробиологии
Действующее вещество ›› Абциксимаб* (Abciximab*) Латинское название ReoPro АТХ: ›› B01AC13 Абциксимаб Фармакологическая группа: Антиагреганты Нозологическая классификация (МКБ 10) ›› I20 Стенокардия [грудная жаба] ›› I20.0 Нестабильная… … Словарь медицинских препаратов
ДУША - [греч. ψυχή], вместе с телом образует состав человека (см. статьи Дихотомизм, Антропология), будучи при этом самостоятельным началом; Д. человека заключает образ Божий (по мнению одних отцов Церкви; по мнению других образ Божий заключен во всем… … Православная энциклопедия
- (Apollo, Απόλλων). Божество солнца, сын Зевса и Лето (Латоны), брат близнец богини Артемиды. Аполлон считался также богом музыки и искусств, богом прорицания и покровителем стад и скота. Он принимает живое участие в основании городов и управлении … Энциклопедия мифологии
ДИОНИСИЙ ВЕЛИКИЙ - [греч. Διονύσιος ὁ Μέγας] (кон. II в. 264/5), свт.,исп. (пам. 5 окт., пам. греч. 3 окт.), еп. Александрийский, богослов, церковно общественный деятель. Жизнь Основным источником жизнеописания Д. В. являются сочинения Евсевия Кесарийского… … Православная энциклопедия
- (Actaeon, Άχταίων). Знаменитый охотник, сын Аристея и Автонии. Однажды на охоте он увидел купающуюся Артемиду и ее нимф, за что был превращен богиней в оленя и был растерзан своими 50 псами. По другой легенде, Артемида превратила его в оленя за… … Энциклопедия мифологии
- (Άθηνά), в греческой мифологии богиня мудрости и справедливой войны. Догреческое происхождение образа А. не позволяет раскрыть этимологию имени богини, исходя из данных только греческого языка. Миф о рождении А. от Зевса и Метиды («мудрости»,… … Энциклопедия мифологии
УДК 577.322.24
Д. О. Дормешкин, магистрант (БГТУ);
В. Н. Леонтьев, кандидат химических наук, доцент, заведующий кафедрой (БГТУ);
И. Г. Ивашкевич, кандидат химических наук (ИБОХ НАН Беларуси);
А. А. Гилеп, кандидат химических наук, заведующий лабораторией (ИБОХ НАН Беларуси)
ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ FAB-ФРАГМЕНТОВ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К КОРТИЗОЛУ
В данной работе проведено молекулярное клонирование генов, кодирующих структуру иммуноглобулинов мыши, специфично связывающих стероидный гормон кортизол. Для этого сконструированы праймеры, охватывающие все семейство генов, кодирующих структуру иммуноглобулинов класса G. Созданы молекулярно-генетические конструкции для эффективной экспрессии рекомбинантных антител в клетках Escherichiacoli. Проведена гетерологическая экспрессия Fab-фрагментов антител. Рекомбинантный белок получен в гомогенном состоянии.
The paper dwells upon the molecular cloning of genes coding the structure of mouse immunoglobulins, which can specifically bind steroid hormone cortisol. For these purposes primers, covering all families of genes, which code the structure of immunoglobulins G and molecular-genetic constructions for effective expression of recombinant antibodies in Escherichiacoli, were constructed. Heterologous expression of Fab-fragments was performed. Recombinant protein has been isolated in homogenous state.
Введение. Кортизол (рис. 1) является одним из важнейших стероидных гормонов и необходим для поддержания многих функций организма. Как и другие глюкокортикостерои-ды, кортизол синтезируется в пучковой зоне коры надпочечников из общего предшественника холестерина . Измерение уровня стероидного гормона кортизола в крови имеет большое значение для мониторинга функции гипофиза и коры надпочечников. В настоящее время существует большое множество диагностических систем для количественного определения кор-тизола в биологических жидкостях. Большинство из них так или иначе используют принцип аффинного узнавания кортизола соответствующими антителами (иммуноглобулинам). Актуальной задачей является улучшение функциональных свойств узнающего модуля диагностических систем, а также удешевление их себестоимости. Один из возможных путей решения этой задачи - использование рекомби-нантных антител, обладающих более широким спектром свойств по сравнению с полноформатными антителами.
Рис. 1. Структурная формула кортизола
Иммуноглобулины - семейство гликопро-теинов, представленных в плазме крови и
тканевых жидкостях позвоночных, способных распознавать и связывать чужеродные для организма вещества (антигены). Участок антигена, с которым взаимодействует антитело, называется эпитопом, а участок антитела, за счет которого оно взаимодействует с антигеном, - паратопом .
У высших млекопитающих иммуноглобулины представлены пятью классами ^О, ^М, ^А, ^Е и ^Б. Наибольший практический интерес представляет самый распространенный класс - ^О, который представлен в организме человека четырьмя подклассами (изотипами): ^1, ^2, ДОЗ и ^4.
Иммуноглобулин представляет собой муль-тимерный белок, состоящий из двух идентичных тяжелых цепей и двух легких (рис. 2).
Тяжелая цепь Лёгкая цепь
Рис. 2. Строение молекулы иммуноглобулина
232 ISSN 1683-0377. Труды БГТУ. 2013. № 4. Химия, технология органических веществ и биотехнология
Молекула иммуноглобулина условно может быть разделена на две функциональных субъединицы - Fab-фрагмент (fragment-antigenbinding) и Fc-фрагмент (fragment crystallizable). Fс-фраг-мент состоит из двух пар константных доменов (CH2 и CH3) и отвечает за взаимодействие с клеточными рецепторами при активации иммунного ответа, а также с белками системы комплимента. Fab-фрагмент участвует в распознавании антигена и состоит из одного вариабельного участка (VL и VH) и одного константного (CL и CH1). Между собой отдельные полипептидные цепи связаны дисульфидными связями и нековалентными взаимодействиями . Кроме того, на уровне CH2 участка молекула гликозилирована.
С развитием молекулярно-генетических технологий широкое распространение получили мини-антитела: Fab- (fragment antigen binding) и scFv- (single chain fragment variable) фрагменты, которые способны специфично связывать антиген, но обладают большей проникающей способностью, чем полноразмерные антитела . Fab-фрагмент представляет собой белок массой 50 кДа, состоящий из участка тяжелой цепи (VH и CH1) и легкой цепи, соединенных вместе дисульфидными связями и нековалентными взаимодействиями. Фрагмент, состоящий только из вариабельных участков (VH и VL), соединенных между собой пептидым линкером, представляет собой scFv-фрагмент и обладает молекулярной массой 15 кДа. Рекомбинантные мини-антитела могут быть получены в бактериальной системе экспрессии, в отличие от полноразмерных иммуноглобулинов, Fc-домен которых гликозилирован и, соответственно, требует систем посттрансляционной модификации . Структурой и, соответственно, физико-химическими свойствами фрагментов антител легко манипулировать на генном уровне, и они могут быть превращены в полноразмерные антитела для приобретения эффекторных функций .
Основная часть. Основной задачей являлось получение высокоаффинных Fab-фрагмен-тов антител к стероидному гормону кортизолу.
Моноклональные антитела, продуцируемые гибридомами 5Г-Н2 (получены в Лаборатории химии белковых гормонов ИБОХ НАН Беларуси) способны специфично связывать стероидный гормон кортизол. Однако использование гибридомных линий, продуцирующих мо-ноклональные антитела, имеет ряд существенных недостатков, к которым относятся нестабильность клеточных линий, высокая цена культивирования, невозможность проведение генно-инженерных манипуляций с генами иммуноглобулинов . Кроме того, полученные
по гибридомной технологии антитела могут содержать примеси иммуноглобулинов мыши, которые повышают вероятность ложных результатов при использовании в диагностических системах. Все эти ограничения можно обойти, используя рекомбинантные антитела, полученные с помощью генно-инженерных методов и экспрессируемые в бактериальной системе.
Первым этапом было выделение тотальной РНК из гибридом 5Г-Н2, продуцирующих специфические антитела к стероидному гормону кортизолу. Тотальная РНК выделялась с помощью набора SV Total RNA Isolation (Promega) и использовалась сразу для постановки реакции обратной транскрипции с олиго-^Т)18 прайме-рами для получения кДНК (использовался набор реагентов «Реверта-L» ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора).
Полученная кДНК использовалась к качестве матрицы для амплификация генов, кодирующих структуры тяжелой и легкой цепи иммуноглобулинов. На основе анализа литературных данных и нуклеотидных последовательностей иммуноглобулинов из базы данных IMGT.org были сконструированы специфические вырожденные праймеры, охватывающие все разнообразие генов кДНК, кодирующих легкие и тяжелые цепи иммуноглобулинов класса G мыши. Амплификация проводилась в амплификаторе BioRad Т100 при следующих условиях: денатурация 94оС 4 мин; 30 циклов -денатурация 94оС 1 мин, отжиг 55оС 1 мин, элонгация 72оС 1 мин. Заключительный этап элонгации -72оС 10 мин.
Амплифицированные фрагменты разделяли методом гель-электрофореза в 2%-ном агароз-ном геле с использованием ТАЕ-буфера в присутствии бромистогоэтидия (результаты регистрировали с помощью видеосистемы Gel Imager 2 («Vilber Lourmat»)). В каждом случае проводили положительный и отрицательный контроль амплификации.
После ПЦР продукты амплификации клонировали в вектор pXcmkn12 и секвенировали для подтверждения правильности последовательности клонированной ДНК (определение нуклеотидной последовательности проводили с использованием наборов «ABI PRISM BigDye Terminator v3.1 Ready Reaction Cycler Sequencing Kit», «Big Dye X Terminator Purification Kit» исеквенатора Applied Biosystems 3130). Секве-нирование показало, что клонированная тяжелая цепь относится к типу G2a, что согласуется с изотипом продуцируемых гибридомой антител, а легкая цепь - к типу к.
Для экспрессии Fab-фрагментов антител использовался специально сконструированный
плазмидный вектор pCW-Fab, обеспечивающий высокий уровень экспрессии рекомбинантных антител в периплазматическом пространстве Escherichiacoli .
Для проведения препаративной экспрессии использовались клетки E. coli DH5a, транс-формиованные бицистронным вектором pCW-Fab, содержащим клонированные гены Fab-домена.
Культивирование клеток E. coli DH5a проводилось на TB среде. Индукция клеточной культуры к синтезу белка осуществляли с помощью IPTG (изопропил^^-1-тиогалакто-пиранозид), запускающего транскрипцию посредством индукции лактозного оперона.
Клетки разрушали с использованием гомогенизатора Emulsiflex-C5 при добавлении детергента (CHAPS), ингибитора сериновых про-теаз (PMSF) и ß-меркаптоэтанола. Центрифугированием отделяли разрушенные клетки. Су-пернатант наносился на хроматографическую колонку с ProteinA сефарозой. ProteinA - белок, экспрессирующийся в клетках золотистого стафилококка Staphylococcusaureus и способный аффинно связывать CH1 домен тяжелой цепи иммуноглобулинов.Это позволяет использовать метод аффинной хроматографии для выделения рекомбинантных Fab-фрагментов (использовалась система выделения и очистки белков Bio-Rad «Bio-Logic»).
Гомогенность полученного белка контролировалась с помощью ПААГ электрофореза в де-натурирущих условиях, который показал наличие двух полипептидных цепей с ожидаемой молекулярной массой, что подтверждает эффективность созданных конструкций. Функциональная активность рекомбинантных Fab-фрагментов антител требует дальнейшего изучения.
Заключение. Проведено молекулярное клонирование генов, кодирующих структуру иммуноглобулинов мыши, специфичных к кортизолу. Результаты секвенирования подтвердили принадлежность клонированных фрагментов к классу иммуноглобулинов. Созданные молеку-лярно-генетические конструкции позволили провести гетерологическую экспрессию рекомби-нантных Fab-фрагментов в клетках E.coli. Получен рекомбинантный белок в гомогенном состоянии с соответствующей ожиданиям молекулярной массой. Свойства полученных Fab-фраг-ментов антител требуют дальнейшего изучения.
Коллектив авторов выражает благодарность Лаборатории химии белковых гормонов и лично доктору химических наук Свиридову О. В. и кандидату химических наук Ивашкевич И. Г. за любезно предоставленные клеточные линии гибридом 5Г-Н2.
Литература
1. Spironelli, C. Cortisol and ACTH plasma levels in maternal filicides and violent psychiatric women / C. Spironelli, F. J. Gradante // Psychiatr Res. - 2013. - Vol. 47. - P. 622-627.
2. Иванов, В. Т. Белки иммунной системы. учеб. пособие / В. Т. Иванов; Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина. -М.: ИБХРАН, 1997. - 114 с.
3. Buchner, J. Renaturation, purification and characterization of recombinant Fab-fragments produced in Escherichia coli / J. Buchner, R. Rudolph // Biotechnology (NY). - 1991. - Vol. 9 (2). -P.157-162.
4. Ahmad, Z. A. scFv Antibody: Principles and Clinical Application / Z. A. Ahmad, S. K. Yeap, M. Hamid // Clinical and Developmental Immunology. - 2012. - Vol. 2012. - P. 3-17.
5. Dimitrov, D. S. Therapeutic antibodies:cur-rent state and future trends - is a paradigm change-coming soon? / D. S. Dimitrov, J. D. Marks // Methods in Molecular Biology. - 2009. - Vol. 525. -P. 1-27
6. Jez, J. Significant Impact of Single N-Gly-can Residues on the Biological Activity of Fc-based Antibody-like Fragments / J. Jez, A. Cas-tilho, H. Steinkellner // The Journal of Biological Chemistry. - 2012. - Vol. 29. - P. 24313-24319.
7. Strebe, N. Cloning of Variable Domains from Mouse Hybridoma by PCR / N. Strebe, D. Moosmayer, S. Dubel // Antibody Engineering. -2010. - Vol. 1. - P. 3-14.
8. Rohatgi, S. Systematic design and testing of nested (RT-)PCR primers for specific amplification of mouse rearranged/expressed immu-noglobulin variable region genes from small number of B-cells / S. Rohatgi, P. Ganju, D. Sehgal // Journal of Immunological Methods. - 2008. -Vol. 330. - P. 205-219.
