Tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti (HPLC) je metoda kolonske kromatografije u kojoj je mobilna faza (MP) tekućina koja se kreće kroz kromatografsku kolonu ispunjenu stacionarnom fazom (sorbentom). HPLC kolone karakterizira visoki hidraulički tlak na ulazu u kolonu, zbog čega se HPLC ponekad naziva i "hidrotlačna tekućinska kromatografija".

Ovisno o mehanizmu razdvajanja tvari, razlikuju se sljedeće HPLC opcije: adsorpcija, particija, ionska izmjena, isključenje veličine, kiralna itd.

U adsorpcijskoj kromatografiji do razdvajanja tvari dolazi zbog njihove različite sposobnosti adsorpcije i desorpcije s površine adsorbensa s razvijenom površinom, na primjer silika gela.

U particionoj HPLC, odvajanje se događa zbog razlike u koeficijentima raspodjele tvari koje se odvajaju između stacionarne faze (obično kemijski cijepljene na površinu stacionarnog nosača) i mobilne faze.

Na temelju polariteta, PF i NP HPLC dijele se na normalnu fazu i reverznu fazu.

Normalna faza je varijanta kromatografije koja koristi polarni sorbent (na primjer silikagel ili silikagel s cijepljenim NH 2 ili CN skupinama) i nepolarni PF (na primjer heksan s raznim dodacima). U reverzno-faznoj verziji kromatografije koriste se nepolarni kemijski modificirani sorbenti (na primjer, nepolarni alkilni radikal C 18) i polarne mobilne faze (na primjer, metanol, acetonitril).

U kromatografiji ionske izmjene molekule smjese tvari, disocirane u otopini na katione i anione, razdvajaju se tijekom kretanja kroz sorbent (kationski izmjenjivač ili anionski izmjenjivač) zbog različitih brzina izmjene s ionskim skupinama sorbensa.

U kromatografiji s isključenjem veličine (sita, gel permeacija, gel filtracija) molekule tvari se odvajaju po veličini zbog njihove različite sposobnosti prodiranja u pore stacionarne faze. U ovom slučaju, najveće molekule (s najvećom molekularnom masom) koje mogu prodrijeti u minimalni broj pora stacionarne faze prve napuštaju kolonu, a tvari s malim molekulskim veličinama posljednje.

često se odvajanje ne događa kroz jedan, već kroz nekoliko mehanizama istovremeno.

HPLC metoda može se koristiti za kontrolu kvalitete bilo kojeg neplinovitog analita. Za provođenje analize koriste se odgovarajući instrumenti - tekućinski kromatografi.

Tekućinski kromatograf obično uključuje sljedeće glavne komponente:

– jedinica za pripremu PF-a, uključujući spremnik s mobilnom fazom (ili spremnike s pojedinačnim otapalima uključenim u mobilnu fazu) i sustav za otplinjavanje PF-a;

– crpni sustav;

– miješalica mobilne faze (po potrebi);

– sustav za uvođenje uzorka (injektor);

– kromatografska kolona (može se ugraditi u termostat);

– detektor;

– sustav prikupljanja i obrade podataka.

Pumpni sustav

Pumpe dovode PF u kolonu zadanom konstantnom brzinom. Sastav mobilne faze može biti konstantan ili varirati tijekom analize. U prvom slučaju, proces se naziva izokratski, au drugom - gradijent. Filtri s promjerom pora od 0,45 µm ponekad se postavljaju ispred crpnog sustava za filtriranje mobilne faze. Suvremeni crpni sustav tekućinskog kromatografa sastoji se od jedne ili više kompjuterski upravljanih pumpi. To vam omogućuje promjenu sastava PF-a prema specifičnom programu tijekom gradijentnog eluiranja. Miješanje PF komponenti u mješalici može se dogoditi i pri niskom tlaku (prije pumpi) i pri visokom tlaku (poslije pumpi). Miješalica se može koristiti za pripremu PF i tijekom izokratske elucije, međutim, točniji omjer komponenata se postiže prethodnim miješanjem PF komponenti za izokratski proces. Pumpe za analitičku HPLC omogućuju održavanje konstantnog protoka PF u kolonu u rasponu od 0,1 do 10 ml/min pri tlaku na ulazu u kolonu do 50 MPa. Međutim, preporučljivo je da ta vrijednost ne prelazi 20 MPa. Pulsacije tlaka minimalizirane su posebnim sustavima prigušnica uključenim u dizajn crpki. Radni dijelovi crpki izrađeni su od materijala otpornih na koroziju, što omogućuje upotrebu agresivnih komponenti u PF sastavu.

1

Validirana HPLC-MS/MS metoda razvijena je za identifikaciju i kvantificiranje novog derivata aminokiseline 1,3,4-tiadiazola LXT7-09. Maksimalna osjetljivost masene spektrometrijske detekcije LHT7-09 postignuta je u načinu detekcije pozitivnih iona pri naponu elektrospreja od 5500 V i potencijalu deklasterizacije od 36 V. Identificirani MRM prijelazi potvrdili su kemijsku strukturu novog derivata aminokiseline 1 ,3,4-tiadiazol. Kako bi se LXT7-09 učinkovito izolirao iz višekomponentnih smjesa tiadiazolilamida, razvijen je gradijentni način tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti korištenjem mješavine acetonitrila i deionizirane vode u različitim omjerima kao eluenta. Za ove kromatografske uvjete, vrijeme zadržavanja spoja LHT7-09 je određeno na 11 minuta. Za kvantitativno određivanje spoja LHT7-09 razvijena je kalibracijska otopina za ovisnost površine kromatografskog vrha o koncentraciji otopine.

HPLC-ms/ms

kromatografija

masovna spektrometrija

tiadiazol

1. Kazaishvili Yu.G., Popov N.S. Studija protuupalnog djelovanja novih derivata tiadiazola kod edema šape izazvanog formalinom u štakora / Yu.G. Kazaishvili, N.S. Popov // Suvremena pitanja znanosti i obrazovanja. – 2013. – br. 3. www..

2. Novi derivati ​​tiadiazola s antifungalnim djelovanjem / A.S. Koshevenko [et al.] // Advances in medical mycology. – 2015. – T. 14. – P. 348-351.

3. Sinteza i antitumorsko djelovanje novih furil-2-supstituiranih 1,3,4-tiadiazola, 1,2,4-triazola / T.R. Hovsepyan [et al.] // Chemical-pharmaceutical journal. – 2011. – T. 45. – Broj 12. – S. 3-7.

4. Popov N.S., Demidova M.A. Procjena akutne toksičnosti novog aminokiselinskog derivata tiadiazola pri intraperitonealnoj primjeni miševima / N.S. Popov, M.A. Demidova // Medicinski časopis Gornje Volge. – 2016. – T. 15, br. 1. – str. 9-12.

5. Popov N.S., Demidova M.A. Procjena ulcerogenosti novog aminokiselinskog derivata tiadiazola kada se daje intragastrično štakorima / N.S. Popov, M.A. Demidova // Doktor-diplomski student. – 2017. – Broj 1(80). – str. 71-78.

6. Sinteza i antimikrobna aktivnost amida feniltio- i benzilsulfonooctene kiseline na bazi 2-amino-5-alkil(arilalkil)-1,3,4-tiadiazola / S.A. Serkov [et al.] // Chemical-pharmaceutical journal. – 2014. – T. 48, br. 1. – S. 24-25.

7. Arpit K., Basavaraj M., Sarala P., Sujeet K., Satyaprakash K. Sinteza i farmakološka aktivnost imidazotiadiazolnih derivata // Acta Poloniae Pharmaceutica, Istraživanje lijekova. 2016. Vol. 73.Br. 4. Str. 937-947.

8. Eman M. Flefel, Wael A. El-Sayed, Ashraf M. Mohamed. Sinteza i antikancerogeno djelovanje novog 1-Thia-4-azaspirodekana, njihovog izvedenog tiazolopirimidina i 1,3,4-tiadiazol tioglikozida // Molecules. 2017. br. 22(1). Str. 170.

9. Jorge R.A. Diaz, Gerardo Enrique Cami. Soli 5-amino-2-sulfonamid-1,3,4-tiadiazola, strukturnog i analognog acetazolamida, pokazuju zanimljiva inhibicijska svojstva karboanhidraze, diuretičko i antikonvulzivno djelovanje // Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 2016. Vol. 12.br. 6. Str. 1102-1110.

10. Naiyuan Chen, Wengui D., Guishan L., Luzhi L. Sinteza i antifungalna aktivnost spojeva 1,3,4-tiadiazol-tiazolidinona na bazi dehidroabijetske kiseline // Molecular Diversity. 2016. Vol. 20.br. 4. Str. 897-905.

11. Yomna, I. El-Gazzar, Hanan H. Georgey, Shahenda M. El-Messery. Sinteza, biološka evaluacija i proučavanje molekularnog modeliranja novih (1,2,4-triazol ili 1,3,4-tiadiazol)-metiltio-derivata kinazolin-4(3H)-ona kao inhibitora DHFR // Bioorganic Chemistry. 2017. Vol. 72. Str. 282-292.

Tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti s spektrometrijskom detekcijom mase jedna je od najperspektivnijih metoda za identifikaciju i kvantitativno određivanje lijekova u različitim biološkim objektima. Metoda se odlikuje visokom specifičnošću, preciznošću i mogućnošću određivanja tvari u minimalnim koncentracijama, što omogućuje njezino korištenje za kvantitativno određivanje lijekova tijekom farmakokinetičkih studija i praćenja lijekova, što je značajno za kliničku laboratorijsku dijagnostiku. U tu svrhu potrebno je razviti i validirati metode za kvantitativno određivanje različitih ljekovitih tvari, uključujući i one inovativne, temeljene na HPLC-MS/MS metodi.

Izvorni lijek iz skupine nesteroidnih protuupalnih lijekova je akeksazolamid, novi derivat 1,3,4-tiadiazol amida i akeksaminske kiseline. Značajna prednost ovog spoja je niska toksičnost i niska ulcerogenost. Za provođenje farmakokinetičkih studija i procjenu bioraspoloživosti ovog lijeka različitim načinima primjene potrebno je razviti pouzdanu metodu za njegovo kvantitativno određivanje u biološkim tekućinama.

Svrha ovog istraživanja bio je razvoj tehnike za identifikaciju i kvantitativno određivanje novog nesteroidnog protuupalnog lijeka iz skupine derivata tiadiazola pomoću HPLC-MS/MS.

Materijali i metode

Predmet istraživanja bio je novi derivat tiadiazola s laboratorijskim kodom LHT 7-09, sintetiziran u OJSC "VNTs BAV" (Staraya Kupavna) od strane prof. S.Ya. Skachilova (slika 1).

2-(5-etil-1,3,4-tiadiazolil)amid 2-acetilaminoheksanska kiselina

Riža. 1. Kemijska struktura LHT 7-09 (bruto formula: C 12 H 20N 4 O 2S; molekulska masa 284,4 g/mol)

Priključak LHT 7-09 izgled je prah bijela, koji je praktički netopljiv u vodi, topiv u alkoholu i lako topiv u acetonitrilu.

Za identifikaciju i kvantificiranje LCT 7-09 korištena je validirana metoda tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti s masenom spektrometrijskom detekcijom (HPLC-MS/MS).

Kromatografija je provedena korištenjem tekućinskog kromatografa visoke učinkovitosti Agilent 1260 InfinityII (Agilent Technologies, Njemačka). U istraživanju je korištena analitička kolona Agilent Poroshell 120 EC-C18 2,7 µm 2,1 x 10 mm. Kako bismo izolirali spoj koji se proučava, razvili smo način gradijentne kromatografije. Kao eluenti korišteni su acetonitril, deionizirana voda i amonijev acetat u različitim omjerima.

Za masenu spektrometriju korišten je trostruki kvadrupolni maseni spektrometar ABSciexQTrap 3200 MD (ABSciex, Singapur) s elektrosprej ionskim izvorom (TurboV s TurboIonSpray sondom). Maseni spektrometar kalibriran je testnom otopinom rezerpina u koncentraciji od 6,1×10 -2 mg/l.

Masena spektrometrijska analiza ispitivanih uzoraka provedena je u elektrosprej modu s izravnim ubrizgavanjem uzorka i eluata dobavljenog kromatografom. Izravno ubrizgavanje ispitnih uzoraka u maseni kromatograf provedeno je pumpom na štrcaljku promjera 4,61 mm pri brzini od 10 μl/min.

Prilikom razvoja metode za identifikaciju i kvantificiranje novog derivata tiadiazola odabrani su optimalni uvjeti za tekućinsku kromatografiju visoke učinkovitosti i detekciju mase. U obzir je uzeto vrijeme otpuštanja tvari iz kromatografske kolone i prijelaz MRM (registracija je provedena m/z prekursorski ion na prvom analitičkom kvadrupolu Q1 i m/z produkt iona na drugom analitičkom kvadrupolu Q3). Kako bi se kvantificirao LCT 7-09, konstruiran je kalibracijski grafikon u rasponu koncentracija od 0,397 do 397 ng/ml.

Kao softver Korišten je softver AnalystMD 1.6.2. (ABSciex).

Rezultati i rasprava

U prvoj fazi eksperimentalnog istraživanja provedena je detekcija mase ispitnog uzorka izravnim uvođenjem u detektor mase pomoću pumpe za štrcaljku. U fazi pripreme uzorka pripremljena je otopina LHT 7-09 (500 ng/ml) u smjesi acetonitrila i ionizirane vode u omjeru 2:1 uz dodatak amonijevog acetata (0,1%).

Preliminarni pokusi su pokazali da je u načinu registracije pozitivnih iona osjetljivost određivanja LHT 7-09 veća, a maseni spektar intenzivniji i informativniji nego u načinu registracije negativnih iona. S tim u vezi, u daljnjim istraživanjima korišten je samo način pozitivne ionizacije.

Da bismo dobili intenzivan vrh, odabrali smo sljedeće uvjete otkrivanje mase : pozitivna polarizacija, napon elektrospreja 5500,0 V, potencijal deklasterizacije i potencijal ubrizgavanja - 36,0 odnosno 6,5 V, s tlakom plina zavjese od 20,0 psi i tlakom plina za raspršivanje od 40,0 psi, brzinom 10 μl/min. Raspon skeniranja bio je 270-300 Da.

Analiza dobivenog masenog spektra prvog analitičkog kvadrupola Q1 pokazala je da u ovim uvjetima, zbog dodatka vodikovog protona, nastaje protonirana molekula proučavanog spoja + vrijednosti m/ z 285.2 Da (slika 2).

Riža. 2. Maseni spektar protonirane molekule LHT 7-09 (u načinu pozitivnog iona + skeniranje)

Na drugom analitičkom kvadrupolu Q3 zabilježeni su ioni produkta za ion prekursora s vrijednošću m/z 285.2 Da. Analiza masenog spektra 2. reda pokazala je prisutnost mnogih pikova, od kojih su 3 najintenzivnija - m/z 114,2 Da, m/z 130.2 Da i m/z 75,1 Da (slika 3).

Riža. 3. Maseni spektar iona produkta (u načinu skeniranja pozitivnih iona, ion prekursorm/ z285,2 Da)

Da bi se dobio ionski signal visokog intenziteta, odabrane su optimalne vrijednosti energije u ćeliji sudara Q2 (razmatran je energetski raspon od 0 do 400 V). Za produkt iona s vrijednostima m/ z 114,2 Da, 130,2 Da i 75,1 Da. Optimalna energija u ćeliji sudara bila je 27 V; 23 V i 49 V.

Pretpostavlja se da je proizvod ion s vrijednošću m/ z 114,2 Da je fragment 5-amino-2-etil-1,3,4-tiadiazola, budući da fragmentacija drugih derivata 1,3,4-tiadiazola također otkriva proizvodni ion s istom vrijednošću m/ z. Proizvod ion sa značenjem m/ z 130.2 Da je vjerojatno protonirani dio akeksaminske kiseline. Dakle, rezultati masovne detekcije ispitivanog uzorka potvrdili su kemijsku strukturu novog derivata 1,3,4-tiadiazola.

U sljedećoj fazi eksperimentalne studije ispitivani spoj je analiziran HPLC-masenom spektrometrijom.

U načinu rada HPLC-MS/MS korišteni su sljedeći uvjeti ionizacije: napon elektrospreja 5500,0 V, brzina protoka mobilne faze 400 μL/min, temperatura dušika 400 °C, tlak protoka zavjese i spreja 20,0 odnosno 50,0 psi. Brzina snimanja pojedinačnih spektra mase bila je 100 spektara u sekundi. Da bi se dobio sažeti maseni spektar, na kromatogramu je odabran vremenski period od 10,5-11,5 minuta; Na temelju intenziteta signala produktnih iona konstruirane su krivulje vremenske ovisnosti ionske struje i površine vrha pojedinačnih signala koji odgovaraju ispitivanom spoju. Volumen uzorka unesenog u analitičku kolonu bio je 10 μl.

Za izolaciju ispitivanog spoja korišten je gradijentni način tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti, što je osigurano promjenom sastava eluensa na ulazu u analitičku kolonu. Kao eluenti korišteni su acetonitril, deionizirana voda i amonijev acetat u različitim omjerima. Odabir načina gradijentne kromatografije bio je zbog činjenice da u uvjetima izokratskog načina eluiranja (uključujući korištenje različitih koncentracija acetonitrila) nije bilo moguće dobiti vrh ispitivane tvari simetričnog oblika s vremenom zadržavanja pogodan za analizu. Prema studiji, optimalni režim dovoda eluenta bio je: od 0 do 4 min, koncentracija acetonitrila bila je 1%; od 4 do 8 minuta, linearni porast koncentracije acetonitrila do 99%; od 8 do 12 minuta - izokratski presjek (1% acetonitril). Nakon završetka studije, kromatografska kolona je isprana 30% otopinom acetonitrila 5 minuta.

Korištenjem opisanog kromatografskog načina, dobiven je simetričan vrh dovoljnog intenziteta za proučavani spoj (slika 4).

Riža. 4. Kromatogram LHT 7-09 (analitička kolonaAgilentPoroshell 120 EC-C18 2,7 µm 2,1×10 mm; način gradijentne kromatografije)

Analiza dobivenih kromatograma za otopine LCT 7-09 različitih koncentracija pokazala je da je vrijeme zadržavanja (tR) u ovim uvjetima eluiranja iznosilo 11 minuta i nije ovisilo o koncentraciji ispitivane tvari. S tim u vezi, vrijednost vremena zadržavanja može se koristiti kao dodatni kriterij za potvrdu autentičnosti LHT 7-09 u višekomponentnim smjesama. Značajna je činjenica da se ovi parametri kromatografije mogu koristiti za identifikaciju LHT 7-09 ne samo pomoću detektora mase, već i drugih detektora, uključujući fotometrijski.

Kako bi se kvantificirao novi derivat tiadiazola, konstruiran je kalibracijski grafikon u rasponu koncentracija od 0,397 ng/ml do 397 ng/ml (slika 5).

Riža. 5. Kalibracijski grafikon za određivanje koncentracije LCT 7-09 (na apscisnoj osi je koncentracija LCT 7-09 u ng/ml, na ordinatnoj osi je površina vrha u impulsima)

Za razvoj kalibracijske otopine korištene su otopine LHT 7-09 u koncentracijama od 0,397; 1.980; 3.970; 19.8; 39,7; 198,0; 397,0 ng/ml. Ovisnost površine pika o koncentraciji ispitivanog spoja opisana je sljedećom regresijskom jednadžbom:

y= 8,9e 5 ·x 0,499, vrijednost koeficijenta regresije bila je r=0,9936.

Treba napomenuti da razvijena kalibracijska otopina omogućuje visokoprecizno kvantitativno određivanje ispitivanog spoja u širokom rasponu koncentracija, što omogućuje korištenje ove metode za procjenu kvalitete ljekovite tvari i za provođenje farmakokinetičkih studija.

Stoga je rezultat istraživanja bio razvoj metode za identifikaciju i kvantifikaciju novog aminokiselinskog derivata tiadiazola pomoću HPLC-MS/MS.

zaključke

1. HPLC-MS/MS omogućuje identifikaciju i kvantifikaciju novog aminokiselinskog derivata tiadiazola s velikom točnošću.
2. Masovnu detekciju novog derivata tiadiazola LHT 7-09 treba provesti u načinu skeniranja pozitivnih iona (MRM prijelaz - prekursorski ion Q1 m/ z 285,2 Da; produkt iona Q3 m/ z 114,2 Da, m/ z 130.2 Da i m/ z 75,1 Da).
3. Za izolaciju LCT 7-09 iz višekomponentnih smjesa razvijena je tehnika tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti (analitička kolona Agilent Poroshell 120 EC-C18 2,7 μm 2,1×10 mm; eluens acetonitril: deionizirana voda: amonijev acetat; način gradijenta).

Bibliografska poveznica

Popov N.S., Malygin A.S., Demidova M.A. RAZVOJ HPLC-MS/MS METODE ZA IDENTIFIKACIJU I KVANTITATIVNO ODREĐIVANJE NOVOG DERIVATA TIJADIAZOLA // Suvremeni problemi znanosti i obrazovanja. – 2017. – br. 5.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=26988 (datum pristupa: 01.02.2020.). Predstavljamo vam časopise izdavačke kuće "Akademija prirodnih znanosti"

Ključne riječi

STEROIDI / LIPIDI / KRVNI SERUM / METABOLIČKI PROFIL / INDUSTRIJSKI OTPAD/ STEROIDI / LIPIDI / KRVNI SERUM / METABOLIČKI PROFIL / INDUSTRIJSKI OTPAD

anotacija znanstveni članak o veterinarskim znanostima, autor znanstvenog rada - Chakhovsky Pavel Anatolyevich, Yantsevich Alexey Viktorovich, Dmitrochenko Alesya Egorovna, Ivanchik Alexander Viktorovich

Udarac antropogenih faktora višestruko djeluje na ljudski i životinjski organizam. Zbog njihovog složenog utjecaja, utvrđivanje negativnih učinaka pojedinih čimbenika prilično je težak zadatak. Metabolomička metodologija, koja omogućuje prevladavanje ovih poteškoća, korištena je za procjenu prirode i opsega utjecaja otpada iz proizvodnje kalijevih gnojiva na lipidne profile pokusnih životinja tijekom intranazalnog pražnjenja s otpadom iz proizvodnje kalijevih gnojiva i potrošnja piti vodu, dobivenih iz izvora koji se nalaze u potencijalnoj zoni proizvodnje potaše. Odvajanje lipida iz seruma provedeno je posebno razvijenom tehnikom koja se temelji na ekstrakciji na čvrstoj fazi, čime je moguće ukloniti kolesterol iz uzoraka. Svaki uzorak analiziran je tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti s spektrometrijskom detekcijom mase (HPLC-MS), nakon čega su dobiveni kromatogrami obrađeni analizom glavnih komponenti (PCA) i analizom klastera. Razvijena tehnika omogućuje učinkovito odvajanje hidrofobnih metabolita u krvnom serumu. Utvrđen je lipidni profil krvnog seruma pokusnih životinja, posebice sadržaj fosfolipida i oksisteroida, te su utvrđene razlike u metaboličkim procesima između pokusnih i kontrolnih životinja. U krvnom serumu pokusnih životinja koncentracija oksisteroida bila je povišena u odnosu na kontrolnu skupinu.

Povezane teme znanstveni radovi o veterinarskim znanostima, autor znanstvenog rada je Chakhovsky Pavel Anatolyevich, Yantsevich Alexey Viktorovich, Dmitrochenko Alesya Egorovna, Ivanchik Alexander Viktorovich

• Odgovor organela hepatocita jetre štakora na izlaganje amplitudno moduliranom magnetskom polju industrijske frekvencije

  2014 / Belkin Anatolij Dmitrijevič, Mičurina Svetlana Viktorovna

• Masovna selektivna identifikacija hormonskih lijekova u sirovom mesu. Analiza ß-agonista

  2016 / Kulikovski A.V., Kuznetsova O.A., Ivankin A.N.

• Primjena tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti za određivanje ubikinona u vodenim organizmima

  2003 / Rybin V. G.

• Određivanje N7-etil]-gvanina u urinu štakora kao markera izloženosti sumpornom iperitu

  2017. / Orlova Olga Igorevna, Karakashev Georgij Vasiljevič, Shmurak Vladimir Igorevich, Abzianidze Victoria Vladimirovna, Savelyeva Elena Igorevna

• Razvoj HPLC-MS metode za analizu ursodeoksikolne kiseline u načinu detekcije pozitivno nabijenih iona

  2013 / Krasnov Ilya Aleksandrovich, Bobkov D. E., Zaitseva M., Prisyach S. S., Krasnov N. V.

• Razvoj tehnologije za stvaranje nove generacije test sustava na bazi tromdefenzina za brzu dijagnostiku zaraznih i upalnih bolesti

  2015 / Ivanov Jurij Borisovič, Vasilčenko Aleksej Sergejevič

• Metoda za istovremeno određivanje karbamazepina i karbamazepin-10,11-epoksida pomoću HPLC-MS/ms

  2015 / Rodina T.A., Melnikov E.S., Sokolov A.V., Prokofjev A.B., Arkhipov V.V., Adamov G.V., Pozdnjakov D.L., Olefir Yu.V.

• Sastav masnih kiselina i steroida biljnih ulja

  2006 / Khasanov V.V., Ryzhova G.L., Dychko K.A., Kuryaeva T.T.

• Razvoj i validacija metode određivanja gidazepama u biološkom materijalu pomoću kromatografsko-masene spektrometrije

  2015 / A.V. Čubenko, M.A. Savčenko

• Određivanje ciklosporina a u krvnom serumu za terapijsko praćenje lijekova

  2008 / Fedorova G. A., Podolskaya E. P., Novikov A. V., Lyutvinsky Ya. I., Krasnov N. V.

ANALIZA SERUMSKIH LIPIDNIH PROFILA ZAMORCA ZA RANO OTKRIVANJE PROMJENA U METABOLIZMU POD IZLOŽENOŠĆU ONEČIŠĆIVANJA IZ OKOLIŠA

Izloženost antropogenim čimbenicima ima višestruki učinak na organizam ljudi i životinja. Zbog njihovog složenog utjecaja otkrivanje negativnih učinaka pojedinih čimbenika prilično je kompliciran zadatak. Metabolomička metodologija koja omogućuje prevladavanje ovih poteškoća primijenjena je u evaluaciji prirode i stupnja utjecaja otpada iz proizvodnje kalijevih gnojiva na lipidne profile pokusnih životinja nakon intranazalne inokulacije s otpadom iz proizvodnje kalijevih gnojiva i potrošnje vode za piće dobivene iz izvora nalazi se u zoni potencijalnog djelovanja proizvodnje kalijevih gnojiva. Izolacija lipida iz seruma provedena je uz pomoć posebno razvijene tehnike koja se temelji na ekstrakciji uzoraka na čvrstoj fazi koja omogućuje uklanjanje kolesterola iz uzoraka. Svaki uzorak podvrgnut je HPLC-MS analizi, nakon čega su dobiveni kromatogrami obrađeni metodom analize glavnih komponenti i klaster analize. Razvijena tehnika omogućuje učinkovito odvajanje hidrofobnih metabolita u krvnom serumu. Utvrđen je profil lipida u serumu pokusnih životinja, posebice sadržaj fosfolipida i oksisteroida, te su utvrđene razlike u metaboličkim procesima pokusnih i kontrolnih životinja. Pokazano je da je u serumu pokusnih životinja uočena povećana koncentracija hidroksisteroida u usporedbi s kontrolnom skupinom.

Tekst znanstvenog rada na temu "HPLC-MS metoda za analizu lipidnih profila krvnog seruma zamorca za prepoznavanje ranih promjena u metabolizmu pri izlaganju zagađivačima iz okoliša"

[hijena i sanitarije 3/2014

Chakhovsky P.A.1, Yantsevich A.V.2, Dmitrochenko A.E.2, Ivanchik A.V.2

HPLC-MS-TEHNIKA ZA ANALIZU SERUMSKIH LIPIDNIH PROFILA

zamorcima za otkrivanje ranih metaboličkih promjena kada su izloženi zagađivačima iz okoliša

TU "Republički znanstveni i praktični centar za higijenu", 220012, Minsk, Republika Bjelorusija; ^Institut za bioorgansku kemiju Nacionalne akademije znanosti Bjelorusije, 220141, Minsk, Republika Bjelorusija

Utjecaj antropogenih čimbenika višestruko djeluje na ljudski i životinjski organizam. Zbog njihovog složenog utjecaja, utvrđivanje negativnih učinaka pojedinih čimbenika prilično je težak zadatak. Za procjenu prirode i stupnja utjecaja otpada iz proizvodnje kalijevih gnojiva na lipidne profile pokusnih životinja tijekom intranazalne inokulacije otpadom iz proizvodnje kalijevih gnojiva i potrošnje korištena je metabolomička metodologija koja omogućuje prevladavanje ovih poteškoća. vode za piće dobivene iz izvora koji se nalaze u zoni potencijalnog djelovanja proizvodnje potaše. Odvajanje lipida iz seruma provedeno je posebno razvijenom tehnikom koja se temelji na ekstrakciji na čvrstoj fazi, čime je moguće ukloniti kolesterol iz uzoraka. Svaki uzorak analiziran je tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti s spektrometrijskom detekcijom mase (HPLC-MS), nakon čega su dobiveni kromatogrami obrađeni analizom glavnih komponenti (PCA) i analizom klastera. Razvijena tehnika omogućuje učinkovito odvajanje hidrofobnih metabolita u krvnom serumu. Utvrđen je lipidni profil krvnog seruma pokusnih životinja, posebice sadržaj fosfolipida i oksisteroida, te su utvrđene razlike u metaboličkim procesima između pokusnih i kontrolnih životinja. U krvnom serumu pokusnih životinja koncentracija oksisteroida bila je povišena u odnosu na kontrolnu skupinu.

Ključne riječi: steroidi; lipidi; krvni serum; metabolički profil; industrijski otpad.

P. A. Chakhovskiy1, A.V Yantsevich2, A. E. Dmitrochenko2, A. V. Ivanchik2 - ANALIZA SERUMSKIH LIPIDNIH PROFILA U ZAMORCA ZA RANO OTKRIVANJE PROMJENA U METABOLIZMU POD IZLOŽENOŠĆU ONEČIŠĆIVANJA IZ OKOLIŠA

1 Republički znanstveni i praktični centar za higijenu, Minsk, Republika Bjelorusija, 220012; 2Institut za bioorgansku kemiju, Minsk, Republika Bjelorusija, 220141

za dopisivanje: Chakhovsky Pavel Anatolyevich, chahovsky@gmail. com

Izloženost antropogenim čimbenicima ima višestruki učinak na organizam ljudi i životinja. Zbog njihovog složenog utjecaja otkrivanje negativnih učinaka pojedinih čimbenika prilično je kompliciran zadatak. Metabolomička metodologija koja omogućuje prevladavanje ovih poteškoća primijenjena je u evaluaciji prirode i stupnja utjecaja otpada iz proizvodnje kalijevih gnojiva na lipidne profile pokusnih životinja nakon intranazalne inokulacije s otpadom iz proizvodnje kalijevih gnojiva i potrošnje vode za piće dobivene iz izvora nalazi se u zoni potencijalnog djelovanja proizvodnje kalijevog gnojiva. Izolacija lipida iz seruma provedena je uz pomoć posebno razvijene tehnike koja se temelji na ekstrakciji uzoraka na čvrstoj fazi koja omogućuje uklanjanje kolesterola iz uzoraka. Svaki uzorak je podvrgnut HPLC -MS analizi, nakon čega su dobiveni kromatogrami obrađeni metodom analize glavnih komponenti i klaster analize. Razvijena tehnika omogućuje učinkovito odvajanje hidrofobnih metabolita u krvnom serumu. Utvrđen je profil lipida u serumu pokusnih životinja, posebice sadržaj fosfolipida i oksisteroida, te su utvrđene razlike u metaboličkim procesima pokusnih i kontrolnih životinja. Pokazano je da je u serumu pokusnih životinja uočena povećana koncentracija hidroksisteroida u usporedbi s kontrolnom skupinom.

Ključne riječi: steroidi, lipidi, krvni serum, metabolički profil, industrijski otpad.

Uvod

Jedan od najvažnijih zadataka sistemske biologije i funkcionalne genetike je integracija proteomike, transkriptomike i informacija o metaboličkim procesima koji se odvijaju u tijelu. Bilo koja bolest ili patološki proces koji se javlja u tijelu odražava se u sadržaju metabolita niske molekularne težine u tkivima i krvi. Za integralne karakteristike niskomolekularnih metabolita u krvnoj plazmi uveden je pojam „metabolički profil” 1971. godine. Budući da je istovremena analiza više klasa metabolita iznimno teška i nepraktična, niz tehnika, uključujući spektroskopiju nuklearne magnetske rezonancije (NMR), obično se koristi za proučavanje metaboličkih profila visoka rezolucija i kromatografija-masena spektrometrija.

U pravilu, kada se provode metabolomičke studije, one su ograničene na određenu skupinu tvari koje se odvajaju od ostalih komponenti tijekom pripreme uzorka. Dobivene grupne podatke lakše je interpretirati.

Metabolički profili (osobito urin i krvna plazma) mogu se koristiti za određivanje prirode fizioloških promjena uzrokovanih unosom toksičnih spojeva. U mnogim slučajevima, opažene promjene mogu dati dodatnu karakterizaciju specifičnih lezija, kao što su jetra i masno tkivo.

Veliki dijagnostički potencijal ima analiza steroida i lipida u krvnom serumu. Lipidni sastav krvnog seruma, steroidni hormoni, njihovi prekursori i proizvodi njihovih metaboličkih transformacija karakteriziraju mnoge funkcionalne parametre tijela. Ove tvari igraju važnu koordinacijsku ulogu u regulaciji metabolizma i kardiovaskularne funkcije te sudjeluju u odgovoru tijela na akutni i kronični stres.

Steroidni profil je jedinstveni dijagnostički kriterij za niz ginekoloških i onkoloških bolesti povezanih s poremećenom sintezom i metabolizmom steroidnih hormona, dok se neke od njih mogu dijagnosticirati samo steroidnim profilom. U analizi profila mogućnost korištenja apsolutne vrijednosti kao jednostavne varijable i uspoređujući ih s normom. Međutim, promjena omjera količina može biti važnija. Osim toga, profil steroida pruža informacije o velikom broju steroida u isto vrijeme.

Određivanje serumskog steroidnog profila učinkovita je metoda za prepoznavanje gotovo svih poremećaja metabolizma steroida, što omogućuje dijagnosticiranje

točna dijagnoza u mnogim kliničkim situacijama, na primjer, s kongenitalnom hiperplazijom nadbubrežne žlijezde, hiperaldosteronizmom tipa I, primarnim hiperaldosteronizmom, Itsenko-Cushingovom bolešću, insuficijencijom nadbubrežne žlijezde itd. Steroidni profil važan je u dijagnostici poremećaja spolne diferencijacije i funkcije gonada, kao kao i hipotalamus hipofizno-nadbubrežna insuficijencija.

Pretjerani unos soli, koja je dominantna komponenta otpada kalijevog gnojiva, u organizam pokusnih štakora s prekomjernom tjelesnom težinom dovodi do prekomjerne aktivacije sinteze aldosterona te uzrokuje hipertenziju i oštećenje bubrega s metaboličkim sindromom.

U regijama industrijske proizvodnje s visok stupanj zagađenja okoliša, stopa morbiditeta stanovništva obično je veća nego u relativno "čistim" regijama. Predmet našeg istraživanja bio je grad Soligorsk, koji se nalazi u zoni velikog rudarenja i prerade kalijeve rude. U područjima odlagališta soli i skladišta mulja tvornica kalije formirana je zona kloridno-natrijevog saliniteta koja pokriva podzemne vode do dubine veće od 100 m, što može utjecati na onečišćenje izvora pitke vode i atmosferskog zraka. .

Za procjenu utjecaja onečišćenja pojedinih komponenti okoliša u regiji industrijske proizvodnje kalijevih gnojiva analizirali smo lipidne profile krvnog seruma kao pokazatelja ranih metaboličkih poremećaja pod utjecajem mješavine kemikalija.

Svrha rada je metodom tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti s masenom spektrometrijskom detekcijom identificirati metaboličke promjene u laboratorijskih životinja izloženih otpadu iz proizvodnje kalijevih gnojiva i konzumaciji vode za piće dobivene iz izvora potencijalno zahvaćenih proizvodnim otpadom. (HPLC-MS).

Predmet istraživanja bio je krvni serum pokusnih životinja (zamorčića) pokusne i kontrolne skupine.

Materijali i metode

Eksperimentalne studije provedeno na 35 zamoraca (17 ženki i 18 mužjaka) težine 305-347 g.

[hijena i sanitarije 3/2014

Eksperimentalna skupina (pripremanje otpadom iz industrijske proizvodnje kalijevih gnojiva i pitkom vodom iz vodoopskrbnog sustava Soligorsk), 20 jedinki (10 ženki i 10 muškaraca);

Kontrolna skupina (primiranje izotoničnom otopinom natrijevog klorida kako bi se isključili učinci faktora stresa uzrokovanog postupkom primanja), 15 jedinki (8 muškaraca i 7 žena).

Tijekom pokusa svakodnevno je praćeno opće stanje životinja, potrošnja hrane i vode.

Za modeliranje kronične inhalacijske izloženosti (12 tjedana) otpadu iz proizvodnje kalijevih gnojiva vodili smo se MU.br. 11-11-10-2002 „Zahtjevi za provođenje toksikoloških i alergoloških studija tijekom higijenske regulative aerosola koji sadrže proteine ​​u zrak radnog područja”, uključujući određivanje početne doze. Uzorci s deponija soli usitnjeni su u mramornom tarioniku do homogenog praškastog stanja, otopljeni u destiliranoj vodi do potrebne koncentracije, uzimajući u obzir tjelesnu masu pokusnih životinja (tjelesna težina praćena je tjedno radi prilagođavanja doze). Izračunate doze bile su: na početku eksperimenta - 2,028 mg/0,1 cm3, nakon 4 tjedna - 2,85 mg/0,1 cm3, nakon 6 tjedana - 3,17 mg/0,1 cm3, nakon 8 tjedana i do kraja eksperimenta 3,8 mg/0,1 cm3.

Zamorac bez anestezije fiksiran je u ležećem položaju s podignutom glavom, a doza tople otopine ubrizgavana je naizmjenično u nosnice (djelomično) pipetom (tijekom 2-3 minute) na način da se spriječi kihanje. . Rezultirajući zvukovi "škripanja" potvrdili su prodor otopine u respiratorni trakt.

Eksperimentalna skupina životinja "inhalirala" je smjesu jednom dnevno, 5 dana u tjednu tijekom 12 tjedana. Životinje kontrolne skupine "inhalirale" su fiziološku otopinu (0,9% NaCl).

Za odabir biološki materijalŽivotinje su anestezirane (eter anestezija), a krv je sakupljena nakon dekapitacije. Serum je dobiven centrifugiranjem na 3000 okretaja u minuti tijekom 15 minuta i pohranjen na -20 C za daljnja ispitivanja. U krvnom serumu analizirani su fosfolipidi, oksisteroidi i masne kiseline.

Priprema uzorka. Krvnom serumu dodan je interni standard, progesteron, do koncentracije od 10-5 M (10 μl na 1 ml uzorka). Zatim je, kako bi se istaložili proteini sadržani u uzorku i ekstrahirali steroidi, dodan metanol do konačne koncentracije od 70% (2,33 ml metanola po 1 ml uzorka), nakon čega je uslijedilo centrifugiranje 15 minuta na 10 000 g. Proteini sadržani u uzorku formirali su gusti sediment. Supernatant je odvojen od precipitata i propušten kroz predkondicioniranu kolonu za ekstrakciju čvrste faze (SPE) koja sadrži 100 mg oktadecilsilil silikagela. SPE kolona je kondicionirana uzastopnim propuštanjem 2 mL metanola, 2 mL vode i 2 mL 70% metanola. U prvoj fazi, kolesterol, čiji je sadržaj u krvnoj plazmi i drugim biološkim tekućinama prilično visok, kao i niz drugih visoko hidrofobnih lipida, veže se na kolonu. Nakon vezanja kolesterola, kolona je dalje isprana sa 2 ml 70% metanola. Ako postoji visok sadržaj kolesterola u uzorku ili veliki volumen uzorka, koristite

Koristili smo SPE kolonu s visokim sadržajem sorbenta. Eluati su spojeni i upareni. Uparavanje je provedeno na 50°C u struji inertnog plina. Suhi ostatak je otopljen u 500 μl metanola i centrifugiran 10 minuta na 10 000 g. U tom slučaju talože se polarni spojevi netopljivi u metanolu. Supernanant je odvojen od sedimenta i razrijeđen vodom do koncentracije metanola od 10%. Dobivena otopina je propuštena kroz prethodno kondicioniranu SPE kolonu (propušteno je 2 ml metanola, 2 ml vode i 2 ml 10% metanola) i isprana sa 2 ml 10% metanola. Steroidi vezani na kolonu eluirani su s 3 mL 80% metanola. Otopina je uparena, a suhi ostatak otopljen u 100 μl metanola. Dobivena otopina analizirana je pomoću HPLC-MS.

HPLC analiza. Analiza je provedena na Accela kromatografu opremljenom LCQ-Fleet spektrometrijskim detektorom mase. Odvajanje je provedeno na koloni Cosmosil 5C18-MS-II s geometrijskim parametrima 4,6 x 150 mm (Nacalai Tesque, Japan).

Program odvajanja (otapalo A - voda, otapalo B - metanol, brzina protoka 500 μl/min): 5 min 60% B, 12 min - linearni gradijent 60-95% B, 10 min - 95% B, 8 min - linearni gradijent 95-100% B, 5 min - 100% B, 5 min - 60% B.

Za masenu spektrometrijsku analizu korišten je izvor kemijske ionizacije atmosferski pritisak(APCI). Parametri izvora ionizacije: temperatura isparivača - 350°C, protok plina za sušenje - 35 jedinica, protok pomoćnog plina - 5 jedinica, temperatura kapilare - 275°C, napon kapilare - 18 V, napon ionske leće - 80 V. Skeniranje ovisno o korištenim podacima način rada pomoću ionske zamke u rasponu skeniranja 50-1000 m/z.

Kromatogrami dobiveni uporabom masenog spektrometrijskog detektora u modu kemijske ionizacije (ukupna ionska struja) pretvoreni su u tekstualni format pomoću programa Qual Browser iz paketa Xcalibur (Thermo Sci, SAD). Dobiveni podaci obrađeni su metodom glavne komponente implementiranom u paketu Statistica 10 i alatima za klaster analizu i izradu dendrograma. Priručnik je korišten za tumačenje spektra mase i identifikaciju pojedinačnih spojeva.

Rezultati i rasprava

Početna metoda za prilagodbu bila je metoda ekstrakcije čvrste faze steroida iz seruma i krvne plazme, opisana u Macherey-Nagelovom priručniku za ekstrakciju čvrste faze. Vodič za primjenu, koji daje preporuke za korištenje kolona za ekstrakciju čvrste faze. Prilagođena tehnika pripreme uzorka s ekstrakcijom krute faze omogućila je učinkovitu izolaciju fosfolipida, oksisteroida i masnih kiselina iz krvnog seruma zamoraca.

Opisana tehnika kromatografskog odvajanja omogućuje učinkovito odvajanje i steroidnih hormona i lipida prisutnih u serumu.

Uzorci su analizirani prema opisanim metodama. Na sl. 1 (vidi stranicu 2 naslovnice) prikazuje, kao primjer, superponirane kromatograme dobivene analizom 3 uzorka iz pokusne skupine (označeno

Riža. 4. Maseni spektri tvari s vremenom zadržavanja od 21,5 minuta: a - kemijska ionizacija pri atmosferskom tlaku u negativnom načinu rada; b - kemijska ionizacija pri atmosferskom tlaku u pozitivnom načinu rada.

crveno) i 3 uzorka iz kontrolne skupine (plavo). Slična slika zabilježena je iu drugim slučajevima.

Za obradu ovih skupova podataka koristili smo metodu glavne komponente (PCA) i klaster analizu, što je omogućilo utvrđivanje razlika u lipidnim profilima između kontrolne i eksperimentalne skupine. Dobiven PCA dijagram 1. i 2. glavne komponente

kada se smanjuje dimenzija podataka, prikazano je na sl. 2 (vidi 2. naslovnu stranicu). Na grafikonu je lako uočiti da su točke kombinirane u 2 skupine, lokalizirane u kvadrantima 1, 4 i 2, 3, redom. U ovom slučaju, točke koje odgovaraju prototipovima pretežno spadaju u 1. i 4. kvadrant, točke koje odgovaraju kontrolnim uzorcima su lokalizirane u 2. i 3. kvadrantu. Dendrogram dobiven postavljanjem

[hijena i sanitarije 3/2014

Identifikacija vrhova prisutnih u kromatogramu

Vrijeme zadržavanja, min. Glavni vrhovi u "+" načinu rada Glavni vrhovi u "-" načinu rada

19,15 393,7 446,8

448,7 493,5 623,4 524,4

19,35 87 227 271 335,5 353,3 371,2 389.1 448.2 493.3 405,4

21,50 316,1 390,0

430.3 448.4 779,1

23,8 319.4 391,6 429.5 783,2

24,35 414,8 448,8

31,73 313,3 330,9

33,9 231.5 245.5 263,3 281,1 295.1 305.2 371.3 521.0 663.1 279,4

Supstanca

Fosfatidilkolin

Arahidna kiselina

Fosfatidna kiselina 42:4

Arahidna i dokozat-traenska kiselina

Dokozapentaenska

Linolna kiselina

Dihidroksikolesterol

analiza sternuma, prikazana na sl. 3. Dakle, statistička analiza kromatografskih podataka ukazuje na razlike u metaboličkim procesima koji se odvijaju u organizmima pokusnih životinja koje pripadaju kontrolnoj i pokusnoj skupini.

Da bi se identificirale specifične metaboličke promjene, maseni spektri su dešifrirani i identificirani.

navedeni su pojedinačni priključci (vidi tablicu). Volumen uzorka bio je nedovoljan za analizu i nije nam omogućio otkrivanje promjena u profilu steroidnih hormona u serumu. Međutim, u kromatogramu su otkriveni lipidi s srednjim polaritetom.

Pojedinačni spojevi identificirani su analizom masenih spektara tvari snimljenih pod različitim načinima ionizacije. Dakle, maseni spektar tvari u dva načina ionizacije s vremenom zadržavanja od 21,5 min prikazan je na slici. 4. Analiza ovog spektra pokazala je da je tvar diacil-sn-glicerofosfat s Molekularna težina 780 (R1(311) = 20:0 masna kiselina (arahidna kiselina), R2(331) = 22:4 masna kiselina (dokozatetraenska kiselina)).

Utvrđeno je da kromatografski vrh s vremenom zadržavanja od 42,52 min odgovara dihidroksikolesterolu, vjerojatno jednom od prekursora u biosintezi žučnih kiselina. Razlike u sadržaju oksisteroida u krvnom serumu ukazuju na mogući poremećaj u metabolizmu žučnih kiselina. Može se primijetiti da u kromatogramima prikazanim na Sl. 1, u krvnom serumu pokusnih životinja postoji povećana koncentracija oksisteroida u odnosu na kontrolu (vrhovi s vremenom zadržavanja od 35-45 minuta).

zaključak. Tehnika korištena u radu omogućuje rano otkrivanje poremećaja metabolizma lipida pri izlaganju zagađivačima iz okoliša s visokim stupnjem učinkovitosti. Dobiveni rezultati upućuju na to da intranazalna primjena vodenih otopina slanih deponija pokusnim životinjama Cavia porcellus dovodi do promjena u metabolizmu lipida i oksisteroida. Konkretno, opažene povećane razine prekursora žučne kiseline (hidroksisteroida) u životinja mogu biti povezane s disfunkcijom jetre i enzima uključenih u biosintezu žučnih kiselina. Stoga se opisani pristup može koristiti za identifikaciju poremećaja metabolizma lipida kod stanovnika regija s tehnogenim onečišćenjem.

Književnost

1. Horning E.C., Horning M.G. Metabolički profili: metode plinske faze za analizu metabolita. Clin. Chem. 1971; 17(8): 802-9.

2. Constantinou M.A., Tsantili-Kakoulidou A., Andreadou I., Iliodro-mitis E.K., Kremastinos D.T., Mikros E. Primjena NMR-bazirane metabonomije u istraživanju miokardijalne ishemije-reperfuzije, ishemijskog predkondicioniranja i antioksidativne intervencije kod kunića. Eur. J. Pharm. Sci. 2007.; 30 (3-4): 303-14.

3. Lu W., Bennett B.D., Rabinowitz J.D. Analitičke strategije za ciljanu metabolomiku temeljenu na LC-MS. J. Chromatogr. B.Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2008.; 871 (2): 236-42.

4. Novotny M.V., Soini H.A., Mechref Y. Biokemijska individualnost odražena u kromatografskim, elektroforetskim i maseno-spektrometrijskim profilima. J. Chromatogr. B.Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2008.; 866 (1-2): 26-47.

5. German J.B., Gillies L.A., Smilowitz J.T., Živković A.M., Watkins S.M. Lipidomika i profiliranje lipida u metabolomici. Curr. Opin. Lipidol. 2007.; 18 (1): 66-71.

6. Schwarz E., Liu A., Randall H., Haslip C., Keune F., Murray M. i sur. Korištenje steroidnog profiliranja pomoću UPLC-MS/MS kao testa druge razine u probiru novorođenčadi na kongenitalnu hiperplaziju nadbubrežne žlijezde: iskustvo iz Utaha. Pediatr. Res. 2009.; 66 (2): 230-5.

7. Rauh M. Mjerenje steroida s LC-MS/MS. Primjena

Na čl. Chakhovsky i sur.

Riža. 3. Dendrogram konstruiran na temelju klaster analize koji ilustrira grupiranje uzoraka u skupine.

Na čl. Chakhovsky i sur.

Riža. 1. Kombinirani kromatogrami uzoraka 1-3 iz kontrolne skupine (označeno crvenom bojom) i 15-17 iz pokusne skupine (označeno plavom bojom).

Projekcija slučajeva na faktor-ravninu (1 x 2) Slučajevi sa zbrojem kosinusa kvadrata >= 0,00

18/3 9/z 21/1 ■ O

1 posudba "Sh o 28/1" 22/10 41/1 str

Faktor 1: 65,71%

Riža. 2. Grafikon dobiven obradom kromatograma pomoću PCA. Kontrolna skupina označena je plavom bojom, eksperimentalna skupina crvenom bojom.

Upotreba tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti spojene s tandemskom masenom spektrometrijom (HPLC-MS/MS) u kliničkim laboratorijima strahovito je porasla u posljednjih 10 do 12 godina, prema pregledu objavljenom u Clinical Biochemist Reviews. Autori napominju da je specifičnost HPLC-MS/MS analize znatno superiornija u odnosu na imunološke metode i klasičnu tekućinsku kromatografiju visoke učinkovitosti (HPLC) za analizu molekula niske molekulske mase te ima značajno veću propusnost od plinske kromatografije-masene spektrometrije (GC -MS). Popularnost ove metode u rutinskim kliničkim analizama trenutno se objašnjava jedinstvenim mogućnostima metode.

Glavne prednosti HPLC-MS/MS metode su:
• Mogućnost točne kvantitativne analize malih molekula;
• Simultana analiza više ciljnih spojeva;
• Jedinstvena specifičnost;
• Velika brzina analize.

U posljednjih godina Mnogo se pažnje posvećuje vremenu analize i, kao rezultat toga, povećanju produktivnosti laboratorija. Značajna smanjenja vremena analize omogućena su upotrebom kratkih analitičkih kolona za HPLC/MS/MS, dok se dramatično povećava specifičnost analize. Korištenje ionizacije pod atmosferskim tlakom (API), tandemskog trostrukog kvadrupolnog masenog spektrometra i napredne tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti, kao i povezanih tehnika pripreme uzorka, doveli su HPLC-MS/MS na čelo modernih analitičkih metoda za klinička istraživanja.

Glavna područja primjene HPLC/MS/MS u kliničkoj medicini:
• Dobivanje potpunog metaboličkog profila steroidnih panela, purina i pirimidina i drugih spojeva,
  probir novorođenčadi na urođene greške metabolizma (otkrivanje nekoliko desetaka bolesti u jednom testu);
• Terapijski nadzor lijekova - imunosupresiva, perotikonvulziva, antiretrovirusa, antikoagulansa i bilo kojih drugih - bez obzira na dostupnost kompleta proizvođača. Nema potrebe kupovati skupe komplete za svaku tvar - možete razviti vlastite metode;
• Klinička toksikologija – analiza više od 500 narkotičkih spojeva i njihovih metabolita u jednoj analizi, bez potvrdne analize
  proteomika i metabolomika.

Osim toga, HPLC-MSMS se koristi za ispitivanje urinarnih oligosaharida, sulfatida, dugolančanih masne kiseline, dugolančane žučne kiseline, metilmalonska kiselina, istraživanje porfirija, probir bolesnika s poremećajima metabolizma purina i pirimidina.

Primjeri primjene tekućinske kromatografije
u kombinaciji s tandemskom masenom spektrometrijom u kliničkim analizama.

Pregled novorođenčadi: Prvi primjer raširene primjene HPLC-MS/MS u kliničkoj dijagnostici bio je probir urođenih grešaka metabolizma u novorođenčadi. Trenutno je u razvijenim zemljama ovo rutinska metoda i pokriva više od 30 različitih bolesti, uključujući ademiju, aminoacidopatiju i poremećaje oksidacije masnih kiselina. Posebno treba istaknuti studije o urođenim manama koje mogu dovesti do ozbiljnih problema ako se ne pozabave odmah (na primjer, povećanje srca ili jetre ili oticanje mozga). Prednost korištenja HPLC-MS/MS za probir novorođenčadi je mogućnost simultane analize svih aminokiselina i acilkarnitina na brz, jeftin i vrlo specifičan način.

Terapijski nadzor lijekova: Razvoj i uvođenje imunosupresivnog lijeka sirolimusa (rapamicina) za sprječavanje odbacivanja organa nakon transplantacije bio je jedan od glavnih pokretača uvođenja HPLC-MS/MS u kliničke laboratorije. Moderna metoda HPLC-MS/MS omogućuje istovremeno određivanje takrolimusa, sirolimusa, ciklosporina, everolimusa i mikofenske kiseline.

HPLC-MS/MS se također koristi za analizu citotoksičnih, antiretrovirusnih lijekova, tricikličkih antidepresiva, antikonvulziva i drugih lijekova koji zahtijevaju individualno doziranje.

HPLC-MSMS metoda omogućuje odvajanje i kvantifikaciju R- i S-enantiomera varfarina u rasponu koncentracija od 0,1-500 ng/ml.

Narkotici i lijekovi protiv bolova: HPLC-MS/MS naširoko se koristi za analizu ovih spojeva zbog jednostavnosti pripreme uzorka i kratkog vremena analize. Metoda se trenutno koristi u kliničkim laboratorijima za probir prisutnosti širokog spektra lijekova. Jedinstvena specifičnost i osjetljivost metode omogućuje simultanu analizu više od 500 spojeva različitih klasa u jednom uzorku uz minimalnu pripremu uzorka. Dakle, u slučaju analize urina dovoljno je jednostavno razrjeđivanje uzorka 50-100 puta. Pri analizi vlasi, umjesto hrpe od 100-200 vlasi, dovoljna je jedna vlas da se pouzdano identificiraju činjenice upotrebe droga.

Endokrinologija i analiza steroida: HPLC-MS/MS naširoko se koristi u mnogim endokrinološkim laboratorijima za analizu steroida - testosterona, kortizola, aldesterona, progesterona, estriola i mnogih drugih.

Sve više i više laboratorija počinje koristiti HPLC-MS/MS za određivanje razine vitamina D3 i D2 u krvi.

I. Određivanje steroida (steroidni profil).

Bolnički i klinički laboratoriji sada imaju mogućnost obavljanja simultanog određivanja više steroida pomoću HPLC/MS/MS. U tom slučaju nema potrebe za velikim volumenom uzorka, što je posebno važno kod analize pedijatrijskih uzoraka.

Slučajevi u kojima je preporučljivo odrediti nekoliko (profilirajućih) steroida:
• Kongenitalna adrenalna hiperplazija (CAH) je kongenitalni defekt u biosintezi steroida. To je nasljedna skupina bolesti uzrokovana nepravilnim djelovanjem enzima u kori nadbubrežne žlijezde, što dovodi do smanjene proizvodnje kortizola. Za pouzdanu dijagnozu NAS-a preporučuje se mjerenje kortizola, androstenediona i 17-hidroksiprogesterona. HPLC/MS/MS omogućuje točnu kvantifikaciju sva tri steroida u jednoj analizi sa 100% pouzdanošću.
• Rutinski probir novorođenčadi pomoću imunotestova karakterizira visoka stopa pozitivnih i lažno negativnih rezultata. Određivanje pomoću HPLC/MS/MS ne samo kortizola, već i aldosterona i 11-deoksikortizola omogućuje razlikovanje primarne od sekundarne insuficijencije nadbubrežne žlijezde.
• HPLC/MS/MS omogućuje određivanje steroida kod prostatitisa i sindroma kronične boli u zdjelici.
• HPLC-MS/MS može odrediti steroidne profile i identificirati uzroke preranog puberteta povezanog s korom nadbubrežne žlijezde kod male djece. Utvrđeno je da su koncentracije testosterona, androstenediona, dehidroepiandrosterona (DHEA) i njegovog sulfata u te djece bile nešto više nego u starije kontrolne djece.
• Serum aktivnih pušača, pasivnih pušača i nepušača analizira se na prisutnost 15 steroidnih hormona i hormona štitnjače kako bi se istražio odnos između izloženosti pacijenta dimu i koncentracije hormona.
• HPLC/MS/MS koristi se u profiliranju nekih ženskih steroidnih hormona u urinu.
• HPLC/MS/MS korišten je za procjenu koncentracija neuroaktivnih hormona za prevenciju dijabetičke neuropatije.

II. Određivanje hormona štitnjače

Rutinske metode za određivanje hormona štitnjače obično se oslanjaju na radioimunotestove, koji su skupi i otkrivaju samo T3 i T4, što može ograničiti mogućnost određivanja i potpune regulacije funkcije štitnjače.

• Trenutno se pomoću HPLC-MSMS-a provodi istovremena analiza pet hormona štitnjače u uzorcima seruma, uključujući tiroksin (T4), 3,3′,5-trijodtironin (T3), 3,3′,5′- (rT3) , 3 ,3'-dijodtironin (3,3'-T2) i 3,5-dijodtironin (3,5-T2) u rasponu koncentracija 1 -500 ng/ml.
• HPLC/MS/MS metoda također se koristi za analizu sastava hormona kod pacijenata koji su podvrgnuti tireoidektomiji. Nakon operacije određuju se koncentracije tiroksina (T4), trijodtironina (T3), slobodnog T4 i hormona koji stimulira štitnjaču (TSH). Utvrđeno je da je HPLC/MS/MS izvrstan način za utvrđivanje odnosa između TSH i koncentracije hormona štitnjače.
• Za određivanje tiroksina (T4) u ljudskoj slini i serumu korištena je HPLC/MS/MS metoda. Metodu karakterizira visoka reproducibilnost, točnost i granica detekcije od 25 pg/ml. Studije su pokazale da postoji dijagnostički odnos u koncentracijama T4 u slini između eutireoidnih subjekata i pacijenata s Gravesovom bolešću.

HPLC/MS/MS metoda sada ima osjetljivost, specifičnost i točnost potrebnu za pouzdano određivanje svih steroida u biološkim tekućinama i time poboljšava dijagnostičke mogućnosti, posebno u slučaju određivanja skupova steroida.

III. Određivanje 25-hidroksivitamina D pomoću HPLC/MS/MS

25-hidroksi vitamin D (25OD) glavni je cirkulirajući oblik vitamina D i prekursor njegovog aktivnog oblika. (1,25-dihidroksivitamin D). Zbog dugog poluživota, određivanje 25OD je važno za određivanje statusa vitamina D u tijelu bolesnika. Vitamin D postoji u dva oblika: vitamin D3 (kolekalciferol) i vitamin D2 (ergokalciferol). Oba oblika se metaboliziraju u odgovarajuće 25OD oblike. Za dijagnozu je od velike važnosti dostupnost analitičkih metoda kojima se s velikom točnošću mogu odrediti oba oblika vitamina i omogućiti praćenje bolesnika s nedostatkom vitamina D. Dosadašnje metode nisu dopuštale odvojeno određivanje vitamina D2 i D3. Osim toga, pri visokim koncentracijama vitamina D2, detektabilna količina D3 je podcijenjena. Drugi nedostatak je korištenje radioaktivnih izotopa. Korištenje HPLC/MS/MS metode omogućilo je ne samo izbjegavanje uporabe radioaktivnih izotopa, već i odvojeno određivanje obaju aktivnih oblika vitamina.

Metoda je primjenjiva za sljedeće pacijente:
1. Ako sumnjate na nisku razinu vitamina D u tijelu;
2. Ako se sumnja na neobjašnjivu toksičnost;
3. Prilikom pregleda pacijenata koji su podvrgnuti liječenju zbog niske razine vitamina D;
4. Korištenje HPLC/MS/MS omogućilo je odvojeno određivanje oba oblika pri praćenju bolesnika.

IV. Određivanje imunosupresiva HPLC/MS/MS

Nakon transplantacije organa doživotno se moraju uzimati imunosupresivni lijekovi kako bi se izbjeglo odbacivanje. S vrlo uskim terapeutskim rasponom i visokom toksičnošću, imunosupresivi zahtijevaju individualno doziranje kako bi se postigao maksimalan učinak. Stoga je praćenje glavnih imunosupresivnih lijekova: ciklosporina A, takrolimusa, sirolimusa i everolimusa ključno za prilagodbu doze lijekova za svakog pojedinog bolesnika ovisno o koncentraciji lijeka u krvi.

Imunotestovi se još uvijek koriste za praćenje ovih lijekova, ali te su metode skupe i imaju ograničenu specifičnost, točnost i ponovljivost. Postoje slučajevi smrti pacijenata zbog netočne doze imunosupresiva na temelju rezultata dobivenih imunološkim metodama. Trenutno se imunotestovi u kliničkim laboratorijima zamjenjuju HPLC/MS/MS. Tako se na Sveučilišnoj klinici u Münchenu dnevno analizira oko 70 uzoraka na sadržaj sirolimusa i ciklosporina A HPLC/MS/MS sustavom. Svu pripremu uzoraka i kontrolu instrumenata obavlja jedan djelatnik. Laboratorij također prelazi na testiranje takrolimusa ovom metodom.

• Opisana je uporaba HPLC/MS/MS za rutinsko istovremeno određivanje takrolimusa, sirolimusa, askomicina, demetiksisirolimusa, ciklosporina A i ciklosporina G u krvi. Raspon određen koncentracijom je 1,0 - 80,0 ng/ml. Za ciklosporin 25 - 2000 ng/ml. Laboratorij je tijekom godine analizirao više od 50.000 uzoraka.
• Budući da je istovremena primjena takrolimusa i sirolimusa pokazala pozitivan terapijski učinak, razvijena je jednostavna i učinkovita HPLC/MS/MS metoda za njihovo odvojeno određivanje u krvi za kliničku analizu. Analiza jednog uzorka traje 2,5 minute uz točnost u rasponu od 2,46% - 7,04% za takrolimus i 5,22% - 8,30% za sirolimus za cijelu analitičku krivulju. Donja granica detekcije za takrolimus je 0,52 ng / ml, za sirolimus - 0,47 ng / ml.

V. Određivanje homocisteina HPLC/MS/MS

Homocistein je od interesa za kardiovaskularne bolesti (tromboembolije, bolesti srca, ateroskleroza) i druga klinička stanja (depresija, Alzheimerova bolest, osteoporoza, komplikacije u trudnoći itd.). Sadašnje metode za analizu homocisteina, uključujući imunološke testove, su skupe. Brza HPLC/MS/MS metoda za analizu homocisteina razvijena je za rutinsku kliničku upotrebu u analizi velikog broja uzoraka. Ionizacija je provedena metodom elektrospreja. Metoda je ponovljiva, vrlo specifična i točna. Prednosti metode su također niska cijena reagensa i jednostavnost pripreme uzorka. Dnevno je moguće analizirati 500 i više uzoraka.

Zaključak

Treba napomenuti da iako se sada koriste značajno poboljšane metode imunotestiranja, zbog temeljnih tehničkih ograničenja, ova metoda nikada neće imati točnost i specifičnost za ciljnu tvar usporedivu s HPLC-MSMS, osobito u prisutnosti metabolita. To ne samo da dovodi do niske točnosti ELISA metode i visokog postotka lažno pozitivnih i lažno negativnih rezultata, već također ne omogućuje usporedbu rezultata dobivenih u različitim kliničkim odjelima primjenom ELISA metode. Korištenje HPLC-MS/MS uklanja ovaj nedostatak i omogućuje vrlo specifičnu, točnu i brzu analizu velikog broja uzoraka s visokom pouzdanošću u prisutnosti metabolita i odsutnosti interferencije od popratnih i endogenih tvari pronađenih u plazmi i krvi pacijenata.

Unatoč očitoj visokoj cijeni kompleksa instrumenata, kao što je prikazano svjetska praksa, s pravilnim radom, ovaj kompleks plaća za sebe za 1-2 godine. To se događa, prije svega, zbog niske cijene jedne analize zbog istovremene analize desetaka i stotina spojeva i nepostojanja potrebe za kupnjom skupih dijagnostičkih kompleta. Osim toga, laboratorij ima priliku samostalno razviti sve potrebne metode analize i ne ovisiti o proizvođaču kompleta.

Odabir ispravne konfiguracije instrumenata

Postoji veliki broj različitih metoda masene spektrometrije i tipova masenih spektrometara dizajniranih za rješavanje širokog spektra problema - od strukturne identifikacije složenih proteinskih makromolekula težine stotina tisuća Daltona do rutinske kvantitativne analize malih molekula velike propusnosti.

Za uspješno rješenje S obzirom na zadatak, jedan od glavnih uvjeta je odabir prave vrste opreme. Ne postoji univerzalni uređaj koji vam omogućuje rješavanje cijelog niza analitičkih problema. Stoga uređaj dizajniran za rješavanje problema identifikacije mikroorganizama nije sposoban provesti kvantitativnu analizu malih molekula. I obrnuto. Poanta je da, unatoč uobičajeno ime, to su potpuno različiti uređaji koji rade na različitim fizičkim principima. U prvom slučaju, to je time-of-flight maseni spektrometar s laserskim ionizacijskim izvorom - MALDI-TOF, au drugom - trostruki kvadrupol s elektrosprej ionizacijom - HPLC-MSMS.

Drugi najvažniji parametar je odabir ispravne konfiguracije sustava. Postoji nekoliko velikih proizvođača opreme za spektrometriju mase. Uređaji svakog proizvođača imaju ne samo svoje prednosti, već i nedostatke, o kojima obično radije šute. Svaki proizvođač proizvodi vlastitu liniju uređaja. Trošak jednog analitičkog kompleksa kreće se od 100.000 do 1.000.000 ili više dolara. Odabir optimalnog proizvođača i ispravne konfiguracije opreme ne samo da će uštedjeti značajna financijska sredstva, već i učinkovitije riješiti zadatak. Nažalost, ima mnogo primjera gdje je opremanje laboratorija izvršeno bez uzimanja u obzir ovih čimbenika. Rezultat je neiskorištena oprema i bačen novac.

Treći čimbenik koji određuje uspješnost rada laboratorija je osoblje. Rad s masenim spektrometrima zahtijeva visokokvalificirano osoblje. Nažalost, niti jedno sveučilište u Rusiji nema tečaj iz moderne praktične masene spektrometrije, posebno u odnosu na kliničke primjene, a zadaće osposobljavanja osoblja u svakom laboratoriju moraju se rješavati samostalno. Naravno, 2-3 dana uvodne obuke koju provodi proizvođač nakon puštanja opreme u promet nije apsolutno dovoljno za razumijevanje osnova metode i stjecanje vještina rada s uređajem.

Četvrti faktor je nedostatak gotovih metoda analize. Svaki laboratorij ima svoje prioritetne zadatke za koje je potrebno razviti vlastite metode. To može učiniti osoba koja ima najmanje 2-3 godine iskustva u rukovanju uređajem. Proizvođači ponekad daju jednu ili dvije opće metode preporuke, ali ih ne prilagođavaju specifičnim zadaćama laboratorija.

U BioPharmExpert LLC Zapošljavamo stručnjake s dugogodišnjim iskustvom u radu na različitim vrstama masenih spektrometara, kao i razvoju metoda i izvođenju visokoučinkovitih analiza. Stoga pružamo sljedeće usluge:

1. Odabir optimalne konfiguracije uređaja za specifične zadatke klijenta.
2. Kupnja, isporuka i puštanje u rad opreme vodećih proizvođača tandemskih spektrometara mase Obuka osoblja korak po korak u roku od godinu dana od dana puštanja u promet opreme.
3. Skup gotovih tehnika i baza podataka za rješavanje osnovnih kliničkih problema.
4. Razvoj metoda analize i rješavanje specifičnih problema naručitelja u njegovom laboratoriju uz angažman njegovog osoblja.
5. Metodološka podrška u svim fazama rada.