La chromatographie liquide haute performance (HPLC) est une méthode de chromatographie sur colonne dans laquelle la phase mobile (MP) est un liquide se déplaçant dans une colonne de chromatographie remplie d'une phase stationnaire (sorbant). Les colonnes HPLC se caractérisent par une pression hydraulique élevée à l'entrée de la colonne, c'est pourquoi la HPLC est parfois appelée « chromatographie liquide haute pression ».

Selon le mécanisme de séparation des substances, on distingue les options HPLC suivantes : adsorption, partition, échange d'ions, exclusion de taille, chirale, etc.

En chromatographie d'adsorption, la séparation des substances se produit en raison de leurs différentes capacités à adsorber et à désorber de la surface d'un adsorbant à surface développée, par exemple le gel de silice.

Dans la HPLC à partition, la séparation se produit en raison de la différence dans les coefficients de distribution des substances séparées entre la phase stationnaire (généralement greffée chimiquement à la surface d'un support stationnaire) et la phase mobile.

En fonction de la polarité, les HPLC PF et NP sont divisées en phase normale et phase inversée.

La phase normale est une variante de la chromatographie qui utilise un sorbant polaire (par exemple, du gel de silice ou du gel de silice avec des groupes NH 2 ou CN greffés) et un PF non polaire (par exemple, de l'hexane avec divers additifs). Dans la version en phase inverse de la chromatographie, des absorbants non polaires chimiquement modifiés (par exemple, un radical alkyle non polaire C 18) et des phases mobiles polaires (par exemple, le méthanol, l'acétonitrile) sont utilisés.

En chromatographie par échange d'ions, les molécules d'un mélange de substances, dissociées en solution en cations et anions, sont séparées lors de leur déplacement dans un sorbant (échangeur de cations ou échangeur d'anions) en raison de leurs différents taux d'échange avec les groupes ioniques du sorbant.

En chromatographie d'exclusion de taille (tamis, perméation sur gel, filtration sur gel), les molécules de substances sont séparées par taille en raison de leur capacité différente à pénétrer dans les pores de la phase stationnaire. Dans ce cas, les plus grosses molécules (avec le poids moléculaire le plus élevé) capables de pénétrer dans le nombre minimum de pores de la phase stationnaire sont les premières à quitter la colonne, et les substances de petite taille moléculaire sont les dernières à sortir.

souvent, la séparation ne se produit pas par un seul, mais par plusieurs mécanismes simultanément.

La méthode HPLC peut être utilisée pour contrôler la qualité de tout analyte non gazeux. Pour effectuer l'analyse, des instruments appropriés sont utilisés - des chromatographes liquides.

Un chromatographe liquide comprend généralement les principaux composants suivants :

– Unité de préparation du PF, comprenant un conteneur avec la phase mobile (ou des conteneurs avec des solvants individuels inclus dans la phase mobile) et un système de dégazage du PF ;

– système de pompage ;

– mélangeur de phases mobile (si nécessaire) ;

– système d'introduction des échantillons (injecteur);

– colonne chromatographique (peut être installée dans un thermostat) ;

– détecteur;

– système de collecte et de traitement des données.

Système de pompage

Les pompes fournissent du PF à la colonne à une vitesse constante donnée. La composition de la phase mobile peut être constante ou varier au cours de l'analyse. Dans le premier cas, le processus est appelé isocratique et dans le second, gradient. Des filtres d'un diamètre de pores de 0,45 µm sont parfois installés devant le système de pompage pour filtrer la phase mobile. Un système de pompage par chromatographe liquide moderne se compose d’une ou plusieurs pompes contrôlées par ordinateur. Cela permet de modifier la composition du PF selon un programme spécifique lors de l'élution par gradient. Le mélange des composants PF dans un mélangeur peut se produire aussi bien à basse pression (avant les pompes) qu'à haute pression (après les pompes). Le mélangeur peut être utilisé pour préparer le PF et pendant l'élution isocratique. Cependant, un rapport de composants plus précis est obtenu en pré-mélangant les composants du PF pour le processus isocratique. Les pompes pour HPLC analytique permettent de maintenir un débit constant de PF dans la colonne compris entre 0,1 et 10 ml/min à une pression à l'entrée de la colonne allant jusqu'à 50 MPa. Il est toutefois conseillé que cette valeur ne dépasse pas 20 MPa. Les pulsations de pression sont minimisées par des systèmes d'amortisseurs spéciaux inclus dans la conception des pompes. Les parties actives des pompes sont constituées de matériaux résistants à la corrosion, ce qui permet l'utilisation de composants agressifs dans la composition PF.

1

Une méthode HPLC-MS/MS validée a été développée pour identifier et quantifier le nouveau dérivé d’acide aminé 1,3,4-thiadiazole LXT7-09. La sensibilité maximale de détection par spectrométrie de masse du LHT7-09 a été atteinte en mode de détection d'ions positifs à une tension d'électrospray de 5 500 V et un potentiel de dégroupage de 36 V. Les transitions MRM identifiées ont confirmé la structure chimique du nouveau dérivé d'acide aminé de 1 ,3,4-thiadiazole. Pour isoler efficacement le LXT7-09 des mélanges à plusieurs composants de thiadiazolylamides, un mode gradient de chromatographie liquide haute performance a été développé en utilisant un mélange d'acétonitrile et d'eau déminéralisée dans différents rapports comme éluant. Pour ces conditions chromatographiques, le temps de rétention du composé LHT7-09 a été déterminé à 11 minutes. Pour la détermination quantitative du composé LHT7-09, une solution d'étalonnage a été développée pour la dépendance de la surface du pic chromatographique sur la concentration de la solution.

HPLC-ms/ms

chromatographie

spectrométrie de masse

thiadiazole

1. Kazaishvili Yu.G., Popov N.S. Etude de l'activité anti-inflammatoire de nouveaux dérivés du thiadiazole dans l'œdème de la patte induit par le formol chez le rat / Yu.G. Kazaishvili, Nouvelle-Écosse Popov // Enjeux contemporains sciences et éducation. – 2013. – N° 3. www..

2. Nouveaux dérivés du thiadiazole à activité antifongique / A.S. Koshevenko [et al.] // Progrès de la mycologie médicale. – 2015. – T. 14. – P. 348-351.

3. Synthèse et activité antitumorale des nouveaux furyl-2-substitués 1,3,4-thiadiazoles, 1,2,4-triazoles / T.R. Hovsepyan [et al.] // Revue chimico-pharmaceutique. – 2011. – T. 45. – N° 12. – P. 3-7.

4. Popov N.S., Demidova M.A. Évaluation de la toxicité aiguë d'un nouveau dérivé d'acide aminé du thiadiazole lorsqu'il est administré par voie intrapéritonéale à des souris / N.S. Popov, M.A. Demidova // Journal médical de la Haute Volga. – 2016. – T. 15, numéro. 1. – p. 9-12.

5. Popov N.S., Demidova M.A. Évaluation de l'ulcérogénicité d'un nouveau dérivé d'acide aminé du thiadiazole lorsqu'il est administré par voie intragastrique à des rats / N.S. Popov, M.A. Demidova // Étudiante en doctorat. – 2017. – N° 1(80). – p. 71-78.

6. Synthèse et activité antimicrobienne des amides des acides phénylthio- et benzylsulfonylacétiques à base de 2-amino-5-alkyl(arylalkyl)-1,3,4-thiadiazoles / S.A. Serkov [et al.] // Revue chimico-pharmaceutique. – 2014. – T. 48, n° 1. – P. 24-25.

7. Arpit K., Basavaraj M., Sarala P., Sujeet K., Satyaprakash K. Synthèse et activité pharmacologique des dérivés de l'imidazothiadiazole // Acta Poloniae Pharmaceutica, Drug Research. 2016. Vol. 73.Non. 4. P. 937-947.

8. Eman M. Flefel, Wael A. El-Sayed, Ashraf M. Mohamed.Synthèse et activité anticancéreuse du nouveau 1-Thia-4-azaspirodecane, de leurs dérivés thiazolopyrimidine et 1,3,4-Thiadiazole Thioglycosides // Molécules. 2017. Non. 22(1). P. 170.

9. Jorge R.A. Díaz, Gerardo Enrique Cami. Les sels de 5-amino-2-sulfonamide-1,3,4-thiadiazole, un analogue structurel et analogue de l'acétazolamide, présentent des propriétés intéressantes d'inhibition de l'anhydrase carbonique, une action diurétique et anticonvulsive // ​​Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 2016. Vol. 12.Non. 6. P. 1102-1110.

10. Naiyuan Chen, Wengui D., Guishan L., Luzhi L. Synthèse et activité antifongique des composés 1,3,4-thiadiazole-thiazolidinone à base d'acide déhydroabiétique // Diversité moléculaire. 2016. Vol. 20.Non. 4. P. 897-905.

11. Yomna, I. El-Gazzar, Hanan H. Georgey, Shahenda M. El-Messery. Synthèse, évaluation biologique et étude de modélisation moléculaire de nouveaux (1,2,4-triazole ou 1,3,4-thiadiazole)-méthylthio-dérivés de quinazoline-4(3H)-one comme inhibiteurs de la DHFR // Chimie bioorganique. 2017. Vol. 72. P. 282-292.

La chromatographie liquide haute performance avec détection par spectrométrie de masse est l'une des méthodes les plus prometteuses pour l'identification et la détermination quantitative de médicaments dans divers objets biologiques. La méthode se caractérise par une spécificité, une précision et une capacité élevées à déterminer des substances à des concentrations minimales, ce qui lui permet d'être utilisée pour la détermination quantitative de médicaments lors d'études pharmacocinétiques et de surveillance de médicaments, ce qui est important pour les diagnostics de laboratoire clinique. Pour cela, il est nécessaire de développer et de valider des méthodes de dosage quantitatif de diverses substances médicamenteuses, y compris innovantes, basées sur la méthode HPLC-MS/MS.

Le médicament original du groupe des anti-inflammatoires non stéroïdiens est l'acexazolamide, un nouveau dérivé du 1,3,4-thiadiazole amide et de l'acide acexamique. Un avantage significatif de ce composé est sa faible toxicité et sa faible ulcérogénicité. Pour mener des études pharmacocinétiques et évaluer la biodisponibilité de ce médicament par différentes voies d'administration, il est nécessaire de développer une méthode fiable pour sa détermination quantitative dans les fluides biologiques.

Le but de cette étudeétait le développement d'une technique d'identification et de détermination quantitative d'un nouveau médicament anti-inflammatoire non stéroïdien du groupe des dérivés du thiadiazole par HPLC-MS/MS.

Matériels et méthodes

L'objet de l'étude était un nouveau dérivé du thiadiazole portant le code de laboratoire LHT 7-09, synthétisé à l'OJSC "VNTs BAV" (Staraya Kupavna) par le prof. S.Ya. Skachilova (Fig. 1).

Acide 2-(5-éthyl-1,3,4-thiadiazolyl)amide 2-acétylaminohexanoïque

Riz. 1. Structure chimique du LHT 7-09 (formule brute : C 12 H 20N 4 O 2S; masse molaire 284,4 g/mole)

Connexion LHT 7-09 apparence est une poudre blanc, qui est pratiquement insoluble dans l'eau, soluble dans l'alcool et facilement soluble dans l'acétonitrile.

Une méthode validée de chromatographie liquide haute performance avec détection par spectrométrie de masse (HPLC-MS/MS) a été utilisée pour identifier et quantifier le LCT 7-09.

La chromatographie a été réalisée à l'aide d'un chromatographe liquide haute performance Agilent 1260 InfinityII (Agilent Technologies, Allemagne). Une colonne analytique Agilent Poroshell 120 EC-C18 2,7 µm 2,1 x 10 mm a été utilisée dans l'étude. Pour isoler le composé étudié, nous avons développé un mode de chromatographie en gradient. De l'acétonitrile, de l'eau désionisée et de l'acétate d'ammonium dans divers rapports ont été utilisés comme éluants.

Pour la spectrométrie de masse, un spectromètre de masse triple quadripôle ABSciexQTrap 3200 MD (ABSciex, Singapour) avec une source d'ions électrospray (TurboV avec sonde TurboIonSpray) a été utilisé. Le spectromètre de masse a été calibré à l'aide d'une solution test de réserpine à une concentration de 6,1.10 -2 mg/l.

L'analyse par spectrométrie de masse des échantillons étudiés a été réalisée en mode électrospray avec injection directe de l'échantillon et de l'éluat fourni par le chromatographe. L'injection directe des échantillons à tester dans le chromatographe de masse a été réalisée à l'aide d'un pousse-seringue d'un diamètre de 4,61 mm à une vitesse de 10 µl/min.

Lors du développement d’une méthode d’identification et de quantification d’un nouveau dérivé du thiadiazole, des conditions optimales pour la chromatographie liquide haute performance et la détection de masse ont été sélectionnées. Le moment de libération de la substance de la colonne chromatographique et la transition MRM ont été pris en compte (l'enregistrement a été effectué m/z ion précurseur sur le premier quadripôle analytique Q1 et m/z produits ions sur le deuxième quadripôle analytique Q3). Pour quantifier le LCT 7-09, un graphique d'étalonnage a été construit dans la plage de concentrations de 0,397 à 397 ng/ml.

Comme logiciel AnalystMD 1.6.2.Software (ABSciex) a été utilisé.

Résultats et discussion

Lors de la première étape de l'étude expérimentale, la détection de masse de l'échantillon testé a été réalisée en l'introduisant directement dans le détecteur de masse à l'aide d'un pousse-seringue. Au stade de la préparation des échantillons, une solution de LHT 7-09 (500 ng/ml) a été préparée dans un mélange d'acétonitrile et d'eau ionisée dans un rapport de 2 : 1 avec l'ajout d'acétate d'ammonium (0,1 %).

Des expériences préliminaires ont montré que dans le mode d'enregistrement des ions positifs, la sensibilité de détermination du LHT 7-09 était plus élevée et que le spectre de masse était plus intense et plus informatif que dans le mode d'enregistrement des ions négatifs. À cet égard, dans d’autres études, seul le mode d’ionisation positive a été utilisé.

Pour obtenir un pic intense, nous avons sélectionné conditions suivantes détection de masse : polarisation positive, tension d'électrospray 5 500,0 V, potentiel de dégroupage et potentiel d'injection - 36,0 et 6,5 V, respectivement, avec une pression de gaz de rideau de 20,0 psi et une pression de gaz d'atomisation de 40,0 psi, vitesse de 10 μl/min. La plage de numérisation était de 270 à 300 Da.

L'analyse du spectre de masse obtenu du premier quadripôle analytique Q1 a montré que dans ces conditions, du fait de l'ajout d'un proton d'hydrogène, une molécule protonée du composé étudié + se forme avec la valeur m/ z 285,2 Oui (Fig. 2).

Riz. 2. Spectre de masse de la molécule protonée LHT 7-09 (en mode ion positif + scanning)

Sur le deuxième quadripôle analytique Q3, les ions produits ont été enregistrés pour l'ion précurseur avec la valeur m/z 285.2 Oui. L'analyse du spectre de masse du 2ème ordre a montré la présence de nombreux pics, dont 3 étaient les plus intenses - m/z 114,2 Da, m/z 130,2 Da et m/z 75,1 Da (Fig. 3).

Riz. 3. Spectre de masse des ions produits (en mode de balayage des ions positifs, ion précurseurm/ z285.2 Oui)

Pour obtenir un signal ionique de haute intensité, les valeurs d'énergie optimales dans la cellule de collision Q2 ont été sélectionnées (la plage d'énergie de 0 à 400 V a été prise en compte). Pour les ions produits avec des valeurs m/ z 114,2 Da, 130,2 Da et 75,1 Da. L'énergie optimale dans la cellule de collision était respectivement de 27 V ; 23 V et 49 V.

On suppose que l'ion produit avec la valeur m/ z 114,2 Da est un fragment du 5-amino-2-éthyl-1,3,4-thiadiazole, puisque la fragmentation d'autres dérivés du 1,3,4-thiadiazole révèle également un ion produit de même valeur m/ z. Ion de produit avec du sens m/ z 130,2 Da est probablement un fragment protoné de l'acide acexamique. Ainsi, les résultats de détection massive de l'échantillon étudié ont confirmé la structure chimique du nouveau dérivé 1,3,4-thiadiazole.

Lors de l'étape suivante de l'étude expérimentale, le composé testé a été analysé par spectrométrie de masse HPLC.

En mode HPLC-MS/MS, les conditions d'ionisation suivantes ont été utilisées : tension d'électrospray 5 500,0 V, débit de phase mobile 400 μL/min, température de l'azote 400 °C, gaz du rideau et pression du débit de pulvérisation 20,0 et 50,0 psi, respectivement. La vitesse d'enregistrement des spectres de masse uniques était de 100 spectres par seconde. Pour obtenir le spectre de masse résumé, une période de temps de 10,5 à 11,5 minutes a été sélectionnée sur le chromatogramme ; Sur la base de l'intensité du signal des ions produits, des courbes de dépendance temporelle du courant ionique et de la zone de crête des signaux individuels correspondant au composé étudié ont été construites. Le volume de l'échantillon introduit dans la colonne analytique était de 10 µl.

Pour isoler le composé étudié, un mode gradient de chromatographie liquide haute performance a été utilisé, qui a été assuré en modifiant la composition de l'éluant à l'entrée de la colonne analytique. De l'acétonitrile, de l'eau désionisée et de l'acétate d'ammonium dans divers rapports ont été utilisés comme éluants. Le choix d'un mode de chromatographie en gradient était dû au fait que dans des conditions d'élution isocratique (y compris lors de l'utilisation de différentes concentrations d'acétonitrile), il n'était pas possible d'obtenir un pic de la substance d'essai de forme symétrique avec un temps de rétention adapté à l’analyse. Selon l'étude, le mode optimal d'alimentation en éluant était : de 0 à 4 min, la concentration en acétonitrile était de 1 % ; de 4 à 8 minutes, une augmentation linéaire de la concentration en acétonitrile jusqu'à 99 % ; de 8 à 12 minutes - coupe isocratique (1% acétonitrile). A la fin de l'étude, la colonne chromatographique a été lavée avec une solution d'acétonitrile à 30 % pendant 5 minutes.

Lors de l'utilisation du mode de chromatographie décrit, un pic symétrique d'intensité suffisante a été obtenu pour le composé étudié (Fig. 4).

Riz. 4. Chromatogramme LHT 7-09 (colonne analytiqueAgilentPoroshell 120 EC-C18 2,7 µm 2,1 × 10 mm ; mode chromatographie en gradient)

L'analyse des chromatogrammes obtenus pour les solutions LCT 7-09 de différentes concentrations a montré que le temps de rétention (tR) dans ces conditions d'élution était de 11 minutes et ne dépendait pas de la concentration de la substance étudiée. À cet égard, la valeur du temps de rétention peut être utilisée comme critère supplémentaire pour confirmer l'authenticité du LHT 7-09 dans les mélanges multicomposants. Il convient de noter que ces paramètres chromatographiques peuvent être utilisés pour identifier le LHT 7-09 non seulement à l'aide d'un détecteur de masse, mais également d'autres détecteurs, notamment photométriques.

Pour quantifier le nouveau dérivé du thiadiazole, un graphique d'étalonnage a été construit dans la plage de concentrations allant de 0,397 ng/ml à 397 ng/ml (Fig. 5).

Riz. 5. Graphique d'étalonnage pour déterminer la concentration de LCT 7-09 (le long de l'axe des abscisses se trouve la concentration de LCT 7-09 en ng/ml, le long de l'axe des ordonnées se trouve la zone du pic en impulsions)

Pour développer une solution d'étalonnage, des solutions de LHT 7-09 ont été utilisées à des concentrations de 0,397 ; 1.980 ; 3.970 ; 19,8 ; 39,7 ; 198,0 ; 397,0 ng/ml. La dépendance de la surface du pic sur la concentration du composé étudié a été décrite par l'équation de régression suivante :

y= 8,9e 5 ·x 0,499, la valeur du coefficient de régression était r=0,9936.

Il est à noter que la solution d'étalonnage développée permet une détermination quantitative de haute précision du composé étudié dans une large gamme de concentrations, ce qui permet d'utiliser cette méthode pour évaluer la qualité d'une substance médicamenteuse et pour réaliser des études pharmacocinétiques.

Ainsi, le résultat de l’étude a été le développement d’une méthode d’identification et de quantification d’un nouveau dérivé d’acide aminé du thiadiazole par HPLC-MS/MS.

conclusions

1. HPLC-MS/MS permet l’identification et la quantification d’un nouveau dérivé d’acide aminé du thiadiazole avec une grande précision.
2. La détection de masse du nouveau dérivé du thiadiazole LHT 7-09 doit être réalisée en mode balayage d'ions positifs (transition MRM - ion précurseur Q1 m/ z 285.2 Oui ; ions produits Q3 m/ z 114,2 Da, m/ z 130,2 Da et m/ z 75,1 Da).
3. Pour isoler le LCT 7-09 des mélanges multicomposants, une technique de chromatographie liquide haute performance a été développée (colonne analytique Agilent Poroshell 120 EC-C18 2,7 μm 2,1×10 mm ; éluant acétonitrile : eau désionisée : acétate d'ammonium ; mode gradient).

Lien bibliographique

Popov N.S., Malygin A.S., Demidova M.A. DÉVELOPPEMENT D'UNE MÉTHODE HPLC-MS/MS POUR L'IDENTIFICATION ET LA DÉTERMINATION QUANTITATIVE D'UN NOUVEAU DÉRIVÉ DE THIADIAZOLE // Problèmes modernes de la science et de l'éducation. – 2017. – N° 5. ;
URL : http://science-education.ru/ru/article/view?id=26988 (date d'accès : 02/01/2020). Nous portons à votre connaissance les magazines édités par la maison d'édition "Académie des Sciences Naturelles"

Mots clés

STÉROÏDES / LIPIDES / SÉRUM SANGUIN / PROFIL MÉTABOLIQUE / DÉCHETS INDUSTRIELS/ STÉROÏDES / LIPIDES / SÉRUM SANGUIN / PROFIL MÉTABOLIQUE / DÉCHETS INDUSTRIELS

annotation article scientifique sur les sciences vétérinaires, auteur de l'ouvrage scientifique - Chakhovsky Pavel Anatolyevich, Yantsevich Alexey Viktorovich, Dmitrochenko Alesya Egorovna, Ivanchik Alexander Viktorovich

Impact facteurs anthropiques a un effet multiforme sur le corps humain et animal. En raison de leur impact complexe, identifier les effets négatifs de facteurs individuels est une tâche assez difficile. La méthodologie métabolomique, qui permet de surmonter ces difficultés, a été utilisée pour évaluer la nature et l'étendue de l'influence des déchets issus de la production d'engrais potassiques sur les profils lipidiques des animaux de laboratoire lors de l'amorçage intranasal avec les déchets issus de la production d'engrais potassiques et consommation boire de l'eau, obtenu à partir de sources situées dans la zone potentielle de production de potasse. La séparation des lipides du sérum a été réalisée à l'aide d'une technique spécialement développée basée sur l'extraction en phase solide, qui permet d'éliminer le cholestérol des échantillons. Chaque échantillon a été analysé par chromatographie liquide haute performance avec détection par spectrométrie de masse (HPLC-MS), après quoi les chromatogrammes résultants ont été traités par analyse en composantes principales (ACP) et analyse groupée. La technique développée permet de séparer efficacement les métabolites hydrophobes du sérum sanguin. Le profil lipidique du sérum sanguin des animaux de laboratoire a été établi, en particulier la teneur en phospholipides et en oxystéroïdes, et des différences dans les processus métaboliques ont été constatées entre les animaux de laboratoire et les animaux témoins. Dans le sérum sanguin des animaux de laboratoire, la concentration d'oxystéroïdes a été augmentée par rapport au groupe témoin.

Rubriques connexes ouvrages scientifiques sur les sciences vétérinaires, l'auteur de l'ouvrage scientifique est Chakhovsky Pavel Anatolyevich, Yantsevich Alexey Viktorovich, Dmitrochenko Alesya Egorovna, Ivanchik Alexander Viktorovich

• Réponse des organites d'hépatocytes hépatiques de rat à l'exposition à un champ magnétique modulé en amplitude de fréquence industrielle

  2014 / Belkin Anatoly Dmitrievich, Michurina Svetlana Viktorovna

• Identification sélective de masse de médicaments hormonaux dans la viande crue. Analyse ß-agoniste

  2016 / Kulikovsky A.V., Kuznetsova O.A., Ivankin A.N.

• Application de la chromatographie liquide haute performance pour la détermination de l'ubiquinone dans les organismes aquatiques

  2003 / Rybin V.G.

• Détermination de la N7-éthyl]-guanine dans l'urine de rat comme marqueur de l'exposition à l'ypérite soufrée

  2017 / Orlova Olga Igorevna, Karakashev Georgy Vasilievich, Shmurak Vladimir Igorevich, Abzianidze Victoria Vladimirovna, Savelyeva Elena Igorevna

• Développement d'une méthode HPLC-MS pour l'analyse de l'acide ursodésoxycholique en mode détection d'ions chargés positivement

  2013 / Krasnov Ilya Alexandrovitch, Bobkov D.E., Zaitseva M., Prisyach S.S., Krasnov N.V.

• Développement d'une technologie pour créer une nouvelle génération de systèmes de tests basés sur les thromdéfensines pour le diagnostic rapide des maladies infectieuses et inflammatoires

  2015 / Ivanov Youri Borissovitch, Vasilchenko Alexeï Sergueïevitch

• Méthode de détermination simultanée de la carbamazépine et de la carbamazépine-10,11-époxyde par HPLC-MS/ms

  2015 / Rodina T.A., Melnikov E.S., Sokolov A.V., Prokofiev A.B., Arkhipov V.V., Adamov G.V., Pozdnyakov D.L., Olefir Yu.V.

• Composition des acides gras et des stéroïdes des huiles végétales

  2006 / Khasanov V.V., Ryzhova G.L., Dychko K.A., Kuryaeva T.T.

• Développement et validation d'une méthode de dosage du gidazépam dans le matériel biologique par chromatographie-spectrométrie de masse

  2015 / A.V. Chubenko, M.A. Savtchenko

• Dosage de la cyclosporine a dans le sérum sanguin pour le suivi thérapeutique médicamenteux

  2008 / Fedorova G.A., Podolskaya E.P., Novikov A.V., Lyutvinsky Ya.I., Krasnov N.V.

ANALYSE DES PROFILS LIPIDIQUES SÉRIQUES CHEZ LE COCHÉ D'INDE POUR LA DÉTECTION PRÉCOCE DES CHANGEMENTS DU MÉTABOLISME SOUS EXPOSITION À DES CONTAMINANTS ENVIRONNEMENTAUX

L'exposition à des facteurs anthropiques a un impact multiforme sur le corps humain et animal. En raison de leur influence complexe, la détection des effets négatifs de certains facteurs est une tâche plutôt compliquée. La méthodologie métabolomique, qui permet de surmonter ces difficultés, a été appliquée dans l'évaluation de la nature et du degré de l'impact des déchets de production d'engrais potassiques sur les profils lipidiques des animaux de laboratoire après inoculation intranasale avec les déchets de production d'engrais potassiques et consommation d'eau potable obtenue à partir de sources. situé dans la zone d’action potentielle de production d’engrais potassiques. L'isolement des lipides du sérum a été réalisé à l'aide d'une technique spécialement développée basée sur l'extraction en phase solide d'échantillons, qui permet d'éliminer le cholestérol des échantillons. Chaque échantillon a été soumis à une analyse HPLC-MS, après quoi les chromatogrammes obtenus ont été traités à l'aide de la méthode d'analyse en composantes principales et d'analyse groupée. La technique développée permet de séparer efficacement les métabolites hydrophobes dans le sérum sanguin. Il existait un profil lipidique sérique établi des animaux de laboratoire, en particulier la teneur en phospholipides et en oxystéroïdes, et des différences ont été observées dans les processus métaboliques des animaux testés et témoins. Il est démontré que dans le sérum des animaux de laboratoire, on observe une concentration accrue d'hydroxystéroïde par rapport au groupe témoin.

Texte d'un travail scientifique sur le thème "Méthode HPLC-MS pour analyser les profils lipidiques du sérum sanguin de cobaye afin d'identifier les changements précoces du métabolisme en cas d'exposition à des polluants environnementaux"

[hyène et assainissement 3/2014

Chakhovsky P.A.1, Yantsevich A.V.2, Dmitrochenko A.E.2, Ivanchik A.V.2

TECHNIQUE HPLC-MS POUR L'ANALYSE DES PROFILS LIPIDIQUES SÉRUMAUX

cobayes pour détecter les changements métaboliques précoces lorsqu'ils sont exposés à des polluants environnementaux

TU "Centre républicain scientifique et pratique d'hygiène", 220012, Minsk, République de Biélorussie ; ^Institut de chimie bioorganique de l'Académie nationale des sciences de Biélorussie, 220141, Minsk, République de Biélorussie

L'impact des facteurs anthropiques a un effet multiforme sur le corps humain et animal. En raison de leur impact complexe, identifier les effets négatifs de facteurs individuels est une tâche assez difficile. La méthodologie métabolomique, qui permet de surmonter ces difficultés, a été utilisée pour évaluer la nature et le degré d'influence des déchets issus de la production d'engrais potassiques sur les profils lipidiques des animaux de laboratoire lors de l'inoculation intranasale des déchets issus de la production d'engrais potassiques et de leur consommation. d'eau potable provenant de sources situées dans la zone d'action potentielle de la production de potasse. La séparation des lipides du sérum a été réalisée à l'aide d'une technique spécialement développée basée sur l'extraction en phase solide, qui permet d'éliminer le cholestérol des échantillons. Chaque échantillon a été analysé par chromatographie liquide haute performance avec détection par spectrométrie de masse (HPLC-MS), après quoi les chromatogrammes résultants ont été traités par analyse en composantes principales (ACP) et analyse groupée. La technique développée permet de séparer efficacement les métabolites hydrophobes du sérum sanguin. Le profil lipidique du sérum sanguin des animaux de laboratoire a été établi, en particulier la teneur en phospholipides et en oxystéroïdes, et des différences dans les processus métaboliques ont été constatées entre les animaux de laboratoire et les animaux témoins. Dans le sérum sanguin des animaux de laboratoire, la concentration d'oxystéroïdes a été augmentée par rapport au groupe témoin.

Mots clés : stéroïdes ; lipides; sérum sanguin; profil métabolique; déchets industriels.

P. A. Chakhovskiy1, A.V Yantsevich2, A. E. Dmitrochenko2, A. V. Ivanchik2 - ANALYSE DES PROFILS LIPIDIQUES SÉRUMS CHEZ LES COCHONS D'INDE POUR LA DÉTECTION PRÉCOCE DES CHANGEMENTS DU MÉTABOLISME SOUS EXPOSITION À DES CONTAMINANTS ENVIRONNEMENTAUX

1Centre républicain scientifique et pratique d'hygiène, Minsk, République de Biélorussie, 220012 ; 2Institut de chimie bioorganique, Minsk, République de Biélorussie, 220141

pour la correspondance : Chakhovsky Pavel Anatolyevich, chahovsky@gmail. com

L'exposition à des facteurs anthropiques a un impact multiforme sur le corps humain et animal. En raison de leur influence complexe, la détection des effets négatifs de certains facteurs est une tâche plutôt compliquée. La méthodologie métabolomique, qui permet de surmonter ces difficultés, a été appliquée dans l'évaluation de la nature et du degré de l'impact des déchets de production d'engrais potassiques sur les profils lipidiques des animaux de laboratoire après inoculation intranasale avec les déchets de production d'engrais potassiques et consommation d'eau potable obtenue à partir de sources. situé dans la zone d'action potentielle de production d'engrais potassiques. L'isolement des lipides du sérum a été réalisé à l'aide d'une technique spécialement développée basée sur l'extraction en phase solide d'échantillons, qui permet d'éliminer le cholestérol des échantillons. Chaque échantillon a été soumis à une analyse HPLC-MS, après quoi les chromatogrammes obtenus ont été traités à l'aide de la méthode d'analyse en composantes principales et d'analyse groupée. La technique développée permet de séparer efficacement les métabolites hydrophobes dans le sérum sanguin. Il existait un profil lipidique sérique établi des animaux de laboratoire, en particulier la teneur en phospholipides et en oxystéroïdes, et des différences ont été observées dans les processus métaboliques des animaux testés et témoins. Il est démontré que dans le sérum des animaux de laboratoire, on observe une concentration accrue d'hydroxystéroïde par rapport au groupe témoin.

Mots clés : stéroïdes, lipides, sérum sanguin, profil métabolique, déchets industriels.

Introduction

L’une des tâches les plus importantes de la biologie des systèmes et de la génétique fonctionnelle est l’intégration de la protéomique, de la transcriptomique et des informations sur les processus métaboliques se produisant dans l’organisme. Toute maladie ou processus pathologique survenant dans le corps se reflète dans la teneur en métabolites de faible poids moléculaire dans les tissus et le sang. Pour les caractéristiques intégrales des métabolites de faible poids moléculaire dans le plasma sanguin, le terme « profil métabolique » a été introduit en 1971. L’analyse simultanée de plusieurs classes de métabolites étant extrêmement difficile et peu pratique, une série de techniques, notamment la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN), sont couramment utilisées pour étudier les profils métaboliques. haute résolution et chromatographie-spectrométrie de masse.

En règle générale, lors de la réalisation d'études métabolomiques, elles sont limitées à un certain groupe de substances séparées des autres composants lors de la préparation des échantillons. Les données de groupe résultantes sont plus faciles à interpréter.

Les profils métaboliques (en particulier l'urine et le plasma sanguin) peuvent être utilisés pour déterminer la nature des changements physiologiques provoqués par l'absorption de composés toxiques. Dans de nombreux cas, les changements observés peuvent fournir une caractérisation supplémentaire de lésions spécifiques, telles que le foie et le tissu adipeux.

L'analyse des stéroïdes et des lipides dans le sérum sanguin présente un grand potentiel diagnostique. La composition lipidique du sérum sanguin, les hormones stéroïdes, leurs précurseurs et les produits de leurs transformations métaboliques caractérisent de nombreux paramètres fonctionnels de l'organisme. Ces substances jouent un rôle de coordination important dans la régulation du métabolisme et de la fonction cardiovasculaire et sont impliquées dans la réponse de l'organisme au stress aigu et chronique.

Le profil stéroïdien est un critère de diagnostic unique pour un certain nombre de maladies gynécologiques et oncologiques associées à une synthèse et un métabolisme altérés des hormones stéroïdes, tandis que certaines d'entre elles ne peuvent être diagnostiquées que par le profil stéroïdien. En analyse de profil, la possibilité d'utiliser valeurs absolues comme de simples variables et en les comparant à la norme. Cependant, modifier le rapport des quantités peut être plus important. De plus, le profil des stéroïdes fournit des informations sur un grand nombre de stéroïdes en même temps.

La détermination du profil sérique des stéroïdes est une méthode efficace pour identifier presque tous les troubles du métabolisme des stéroïdes, ce qui permet de diagnostiquer

diagnostic précis dans de nombreuses situations cliniques, par exemple avec hyperplasie surrénalienne congénitale, hyperaldostéronisme de type I, hyperaldostéronisme primaire, maladie d'Itsenko-Cushing, insuffisance surrénalienne, etc. Le profil stéroïdien est important dans le diagnostic des troubles de la différenciation sexuelle et de la fonction gonadique, car ainsi que l'insuffisance hypothalamo-hypophyso-surrénalienne.

Un apport excessif de sel, qui est le composant prédominant des déchets d'engrais potassiques, dans le corps de rats expérimentaux présentant un excès de poids entraîne une activation excessive de la synthèse d'aldostérone et provoque une hypertension et des lésions rénales avec syndrome métabolique.

Dans les régions de production industrielle avec haut degré contamination de l’environnement, le taux de morbidité de la population est généralement plus élevé que dans les régions relativement « propres ». L'objet de notre recherche était la ville de Soligorsk, située dans la zone d'exploitation minière et de traitement à grande échelle des minerais de potasse. Dans les zones des décharges de sel et des installations de stockage des boues des usines de potasse, une zone de salinité chlorure-sodium s'est formée, qui recouvre les eaux souterraines jusqu'à une profondeur de plus de 100 m, ce qui peut affecter la pollution des sources d'approvisionnement en eau potable et de l'air atmosphérique. .

Pour évaluer l'impact de la pollution de composants individuels de l'environnement dans la région de production industrielle d'engrais potassiques, nous avons analysé les profils lipidiques du sérum sanguin comme indicateur de troubles métaboliques précoces sous l'influence d'un mélange de produits chimiques.

Le but du travail est d'identifier les changements métaboliques chez les animaux de laboratoire exposés aux déchets issus de la production d'engrais potassiques et de la consommation d'eau potable provenant de sources potentiellement affectées par les déchets de production, en utilisant la méthode de chromatographie liquide à haute performance avec détection par spectrométrie de masse. (HPLC-MS).

L'objet de l'étude était le sérum sanguin d'animaux de laboratoire (cobayes) des groupes expérimentaux et témoins.

Matériels et méthodes

Etudes expérimentales réalisée sur 35 cobayes (17 femelles et 18 mâles) pesant 305-347 g.

[hyène et assainissement 3/2014

Groupe expérimental (amorçage avec des déchets de la production industrielle d'engrais potassiques et de l'eau potable du système d'adduction d'eau de Soligorsk), 20 individus (10 femmes et 10 hommes) ;

Groupe témoin (amorçage avec une solution isotonique de chlorure de sodium pour exclure les effets du facteur de stress provoqué par la procédure d'amorçage), 15 individus (8 hommes et 7 femmes).

Au cours de l'expérience, l'état général des animaux, la consommation de nourriture et d'eau ont été surveillés quotidiennement.

Pour modéliser l'exposition chronique par inhalation (12 semaines) aux déchets issus de la production d'engrais potassiques, nous nous sommes guidés par le MU n° 11-11-10-2002 « Exigences pour la conduite d'études toxicologiques et allergologiques lors de la régulation hygiénique des aérosols contenant des protéines dans l'air de la zone de travail », y compris la détermination de la dose d'amorçage. Des échantillons provenant de décharges de sel ont été broyés dans un mortier de marbre jusqu'à un état poussiéreux homogène, dissous dans de l'eau distillée à la concentration requise, en tenant compte du poids corporel des animaux de laboratoire (le poids corporel a été surveillé chaque semaine pour ajuster la dose). Les doses calculées étaient : au début de l'expérience - 2,028 mg/0,1 cm3, après 4 semaines - 2,85 mg/0,1 cm3, après 6 semaines - 3,17 mg/0,1 cm3, après 8 semaines et jusqu'à la fin de l'expérience 3,8 mg/0,1 cm3.

Un cobaye sans anesthésie a été fixé en décubitus dorsal, la tête relevée, et une dose de solution tiède a été injectée alternativement dans les narines (fractionnellement) à l'aide d'un distributeur de pipettes (pendant 2-3 minutes) de manière à éviter les éternuements. . Les bruits de « squelching » qui en résultent confirment la pénétration de la solution dans les voies respiratoires.

Le groupe expérimental d’animaux a « inhalé » le mélange une fois par jour, 5 jours par semaine pendant 12 semaines. Les animaux du groupe témoin ont « inhalé » une solution saline (NaCl à 0,9 %).

Pour la sélection matériel biologique Les animaux ont été anesthésiés (anesthésie à l'éther) et du sang a été prélevé après décapitation. Le sérum a été obtenu par centrifugation à 3 000 tr/min pendant 15 minutes et conservé à -20 C pour des études ultérieures. Les phospholipides, les oxystéroïdes et les acides gras ont été analysés dans le sérum sanguin.

La préparation des échantillons. Un étalon interne, la progestérone, a été ajouté au sérum sanguin pour atteindre une concentration de 10-5 M (10 µl pour 1 ml d'échantillon). Ensuite, pour précipiter les protéines contenues dans l'échantillon et extraire les stéroïdes, du méthanol a été ajouté jusqu'à une concentration finale de 70 % (2,33 ml de méthanol pour 1 ml d'échantillon), suivi d'une centrifugation pendant 15 min à 10 000 g. Les protéines contenues dans l’échantillon formaient un sédiment dense. Le surnageant a été séparé du précipité et passé à travers une colonne d'extraction en phase solide (SPE) préconditionnée contenant 100 mg de gel de silice octadécylsilyle. La colonne SPE a été conditionnée en faisant passer successivement 2 mL de méthanol, 2 mL d'eau et 2 mL de méthanol à 70 %. Dans un premier temps, le cholestérol, dont la teneur dans le plasma sanguin et d'autres fluides biologiques est assez élevé, ainsi qu'un certain nombre d'autres lipides hautement hydrophobes, se lient à la colonne. Après liaison du cholestérol, la colonne a ensuite été lavée avec 2 ml de méthanol à 70 %. S'il y a une teneur élevée en cholestérol dans l'échantillon ou un volume d'échantillon important, utilisez

Nous avons utilisé une colonne SPE à haute teneur en sorbant. Les éluats ont été combinés et évaporés. L'évaporation a été réalisée à 50°C dans un courant de gaz inerte. Le résidu sec a été dissous dans 500 µl de méthanol et centrifugé pendant 10 min à 10 000 g. Dans ce cas, des composés polaires insolubles dans le méthanol précipitent. Le surnageant a été séparé du sédiment et dilué avec de l'eau jusqu'à une concentration de méthanol de 10 %. La solution résultante a été passée à travers une colonne SPE préconditionnée (passage de 2 ml de méthanol, 2 ml d'eau et 2 ml de méthanol à 10 %) et lavée avec 2 ml de méthanol à 10 %. Les stéroïdes liés à la colonne ont été élués avec 3 ml de méthanol à 80 %. La solution a été évaporée et le résidu sec a été dissous dans 100 µl de méthanol. La solution résultante a été analysée par HPLC-MS.

Analyse HPLC. L'analyse a été réalisée sur un chromatographe Accela équipé d'un détecteur spectrométrique de masse LCQ-Fleet. La séparation a été réalisée sur une colonne Cosmosil 5C18-MS-II avec des paramètres géométriques de 4,6 x 150 mm (Nacalai Tesque, Japon).

Programme de séparation (solvant A - eau, solvant B - méthanol, débit 500 μl/min) : pendant 5 min 60% B, 12 min - gradient linéaire 60-95% B, 10 min - 95% B, 8 min - linéaire gradient 95-100% B, 5 min - 100% B, 5 min - 60% B.

Pour l'analyse par spectrométrie de masse, une source d'ionisation chimique a été utilisée à pression atmosphérique(APCI). Paramètres de la source d'ionisation : température de l'évaporateur - 350°C, débit de gaz de séchage - 35 unités, débit de gaz auxiliaire - 5 unités, température capillaire - 275°C, tension capillaire - 18 V, tension de la lentille ionique - 80 V. Balayage Data Dependent™ utilisé mode utilisant un piège à ions dans la plage de balayage 50-1000 m/z.

Les chromatogrammes obtenus à l'aide d'un détecteur spectrométrique de masse en mode d'ionisation chimique (courant ionique total) ont été convertis au format texte à l'aide du programme Qual Browser du package Xcalibur (Thermo Sci, USA). Les informations obtenues ont été traitées à l'aide de la méthode des composantes principales implémentée dans le progiciel Statistica 10 et des outils d'analyse groupée et de construction de dendrogrammes. L'ouvrage de référence a été utilisé pour interpréter les spectres de masse et identifier les composés individuels.

Résultats et discussion

La méthode initiale d'adaptation était la méthode d'extraction en phase solide des stéroïdes du sérum et du plasma sanguin, décrite dans le manuel d'extraction en phase solide de Macherey-Nagel. Guide d'application, qui fournit des recommandations pour l'utilisation des colonnes d'extraction en phase solide. Une technique adaptée de préparation d’échantillons avec extraction en phase solide a permis d’isoler efficacement les phospholipides, les oxystéroïdes et les acides gras du sérum sanguin de cobayes.

La technique de séparation chromatographique décrite permet de séparer efficacement à la fois les hormones stéroïdes et les lipides présents dans le sérum.

Les échantillons ont été analysés selon les méthodes décrites. En figue. La figure 1 (voir page 2 de couverture) montre, à titre d'exemple, des chromatogrammes superposés obtenus à partir de l'analyse de 3 échantillons du groupe expérimental (mis en évidence

Riz. 4. Spectres de masse d'une substance avec un temps de rétention de 21,5 minutes : a - ionisation chimique à pression atmosphérique en mode négatif ; b - ionisation chimique à pression atmosphérique en mode positif.

en rouge) et 3 échantillons du groupe témoin (en bleu). Une image similaire a été observée dans d’autres cas.

Pour traiter ces ensembles de données, nous avons utilisé la méthode des composantes principales (ACP) et l'analyse groupée, qui ont permis d'identifier les différences de profils lipidiques entre les groupes témoin et expérimental. Tracé PCA des 1ère et 2ème composantes principales obtenues

lors de la réduction de la dimension des données, est illustré à la Fig. 2 (voir 2ème page de couverture). Sur le graphique, il est facile de remarquer que les points sont regroupés en 2 groupes, localisés respectivement dans les quadrants 1, 4 et 2, 3. Dans ce cas, les points correspondant aux prototypes rentrent majoritairement dans les 1er et 4ème quadrants, les points correspondant aux échantillons témoins sont localisés dans les 2ème et 3ème quadrants. Le dendrogramme obtenu en plaçant

[hyène et assainissement 3/2014

Identification des pics présents dans le chromatogramme

Temps de rétention, min Principaux pics en mode « + » Principaux pics en mode « - »

19,15 393,7 446,8

448,7 493,5 623,4 524,4

19,35 87 227 271 335,5 353,3 371,2 389.1 448.2 493.3 405,4

21,50 316,1 390,0

430.3 448.4 779,1

23,8 319.4 391,6 429.5 783,2

24,35 414,8 448,8

31,73 313,3 330,9

33,9 231.5 245.5 263,3 281,1 295.1 305.2 371.3 521.0 663.1 279,4

Substance

Phosphatidylcholine

Acide arachidique

Acide phosphatidique 42:4

Acides arachidique et docosate-trénoïque

Docosapentaénoïque

L'acide linoléique

Dihydroxycholestérol

analyse du sternum, illustrée à la Fig. 3. Ainsi, l'analyse statistique des données chromatographiques indique des différences dans les processus métaboliques se produisant dans les organismes des animaux de laboratoire appartenant aux groupes témoin et expérimental.

Pour identifier des changements métaboliques spécifiques, des spectres de masse ont été déchiffrés et identifiés.

des connexions individuelles sont spécifiées (voir tableau). Le volume de l’échantillon était insuffisant pour l’analyse et ne nous a pas permis de détecter des modifications du profil des hormones stéroïdes dans le sérum. Cependant, des lipides de polarité intermédiaire ont été détectés dans le chromatogramme.

Des composés individuels ont été identifiés en analysant les spectres de masse des substances enregistrées sous différents modes d'ionisation. Ainsi, le spectre de masse de la substance dans deux modes d'ionisation avec un temps de rétention de 21,5 min est présenté sur la figure. 4. L'analyse de ce spectre a montré que la substance est du diacyl-sn-glycérophosphate avec masse moléculaire 780 (R1(311) = 20:0 acide gras (acide arachidique), R2(331) = 22:4 acide gras (acide docosatétraénoïque)).

Il a été constaté que le pic chromatographique avec un temps de rétention de 42,52 min correspond au dihydroxycholestérol, vraisemblablement l'un des précurseurs de la biosynthèse des acides biliaires. Les différences dans la teneur en oxystéroïdes dans le sérum sanguin indiquent un possible trouble du métabolisme des acides biliaires. On peut noter que sur les chromatogrammes présentés sur la Fig. 1, dans le sérum sanguin des animaux de laboratoire, il existe une concentration accrue d'oxystéroïdes par rapport au contrôle (pics avec un temps de rétention de 35 à 45 minutes).

conclusion. La technique utilisée dans les travaux permet de détecter avec une grande efficacité les troubles précoces du métabolisme lipidique lors de l'exposition à des polluants environnementaux. Les résultats obtenus indiquent que l'administration intranasale de solutions aqueuses de décharges de sel à des animaux expérimentaux Cavia porcellus entraîne des modifications du métabolisme des lipides et des oxystéroïdes. En particulier, l’augmentation des taux de précurseurs des acides biliaires (hydroxystéroïdes) observée chez les animaux peut être associée à un dysfonctionnement du foie et des enzymes impliquées dans la biosynthèse des acides biliaires. Ainsi, l'approche décrite peut être utilisée pour identifier les troubles du métabolisme lipidique chez les habitants des régions à pollution technogénique.

Littérature

1. Horning E.C., Horning M.G. Profils métaboliques : méthodes en phase gazeuse pour l'analyse des métabolites. Clin. Chimique. 1971 ; 17(8) : 802-9.

2. Constantinou M.A., Tsantili-Kakoulidou A., Andreadou I., Iliodro-mitis E.K., Kremastinos D.T., Mikros E. Application de la métabonomique basée sur la RMN dans l'étude de l'ischémie-reperfusion myocardique, du préconditionnement ischémique et de l'intervention antioxydante chez le lapin. EUR. J.Pharm. Sci. 2007 ; 30(3-4) : 303-14.

3. Lu W., Bennett BD, Rabinowitz J.D. Stratégies analytiques pour la métabolomique ciblée basée sur LC-MS. J. Chromatogr. B. Analyste. Technologie. Bioméde. Sciences de la vie. 2008 ; 871(2) : 236-42.

4. Novotny M.V., Soini H.A., Mechref Y. Individualité biochimique reflétée dans les profils chromatographiques, électrophorétiques et spectrométriques de masse. J. Chromatogr. B. Analyste. Technologie. Bioméde. Sciences de la vie. 2008 ; 866(1-2) : 26-47.

5. German J.B., Gillies L.A., Smilowitz J.T., Zivkovic A.M., Watkins S.M. Lipidomique et profilage lipidique en métabolomique. Curr. Avis. Lipidol. 2007 ; 18(1) : 66-71.

6. Schwarz E., Liu A., Randall H., Haslip C., Keune F., Murray M. et al. Utilisation du profilage des stéroïdes par UPLC-MS/MS comme test de deuxième niveau dans le dépistage néonatal de l'hyperplasie surrénalienne congénitale : l'expérience de l'Utah. Pédiatre. Rés. 2009 ; 66(2) : 230-5.

7. Rauh M. Mesure de stéroïdes avec LC-MS/MS. Application

À l'art. Chakhovsky et coll.

Riz. 3. Dendrogramme construit sur la base d'une analyse groupée et illustrant le regroupement des échantillons en groupes.

À l'art. Chakhovsky et coll.

Riz. 1. Chromatogrammes combinés des échantillons 1 à 3 du groupe témoin (surlignés en rouge) et 15 à 17 du groupe expérimental (surlignés en bleu).

Projection des cas sur le plan factoriel (1 x 2) Cas avec somme des cosinus carrés >= 0,00

18/3 9/z 21/1 ■ O

1 prêt "Sh o 28/1" 22/10 41/1 p

Facteur 1 : 65,71%

Riz. 2. Graphique obtenu en traitant des chromatogrammes par PCA. Le groupe témoin est surligné en bleu, le groupe expérimental en rouge.

L'utilisation de la chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse tandem (HPLC-MS/MS) dans les laboratoires cliniques a considérablement augmenté au cours des 10 à 12 dernières années, selon une étude publiée dans Clinical Biochemist Reviews. Les auteurs notent que la spécificité de l'analyse HPLC-MS/MS est nettement supérieure aux méthodes immunologiques et à la chromatographie liquide haute performance (HPLC) classique pour l'analyse de molécules de faible poids moléculaire et a un débit nettement supérieur à celui de la chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC). -MS). La popularité de cette méthode dans les analyses cliniques de routine s'explique actuellement par les capacités uniques de la méthode.

Les principaux avantages de la méthode HPLC-MS/MS sont :
• Possibilité d'analyse quantitative précise de petites molécules ;
• Analyse simultanée de plusieurs composés cibles ;
• Spécificité unique ;
• Grande vitesse d'analyse.

DANS dernières années Une grande attention est accordée au temps d'analyse et, par conséquent, à l'augmentation de la productivité du laboratoire. Des réductions significatives du temps d'analyse sont rendues possibles grâce à l'utilisation de colonnes analytiques courtes pour HPLC/MS/MS, tout en augmentant considérablement la spécificité de l'analyse. L'utilisation de l'ionisation à pression atmosphérique (API), du spectromètre de masse triple quadripôle tandem et de la chromatographie liquide haute performance avancée, ainsi que des techniques de préparation d'échantillons associées, ont placé la HPLC-MS/MS à l'avant-garde des méthodes analytiques modernes pour la recherche clinique.

Principaux domaines d'application de la HPLC/MS/MS en médecine clinique :
• Obtention d'un profil métabolique complet des panels de stéroïdes, purines et pyrimidines et autres composés,
  dépistage des erreurs innées du métabolisme chez les nouveau-nés (détection de plusieurs dizaines de maladies en un seul test) ;
• Suivi thérapeutique des médicaments - immunosuppresseurs, peroticonvulsivants, antirétroviraux, anticoagulants et autres - quelle que soit la disponibilité des kits du fabricant. Il n'est pas nécessaire d'acheter des kits coûteux pour chaque substance - vous pouvez développer vos propres méthodes ;
• Toxicologie clinique – analyse de plus de 500 composés narcotiques et de leurs métabolites en une seule analyse, sans analyse de confirmation
  protéomique et métabolomique.

De plus, HPLC-MSMS est utilisé pour cribler les oligosaccharides urinaires, les sulfatides, les acides à longue chaîne Les acides gras, acides biliaires à longue chaîne, acide méthylmalonique, recherche sur les porphyries, dépistage de patients présentant des troubles du métabolisme des purines et des pyrimidines.

Exemples d'application de la chromatographie liquide
en combinaison avec la spectrométrie de masse tandem dans les analyses cliniques.

Dépistage néonatal : Le premier exemple d’utilisation généralisée de la HPLC-MS/MS dans le diagnostic clinique a été le dépistage des erreurs innées du métabolisme chez les nouveau-nés. Actuellement, dans les pays développés, il s’agit d’une méthode de routine qui couvre plus de 30 maladies différentes, notamment l’acédémie, l’aminoacidopathie et les défauts d’oxydation des acides gras. Il convient de noter en particulier les études sur les malformations congénitales qui peuvent entraîner de graves problèmes si elles ne sont pas traitées rapidement (par exemple, une hypertrophie du cœur ou du foie ou un gonflement du cerveau). L’avantage de l’utilisation de la HPLC-MS/MS pour le dépistage néonatal réside dans la possibilité d’analyser simultanément tous les acides aminés et acylcarnitines de manière rapide, peu coûteuse et hautement spécifique.

Surveillance thérapeutique médicamenteuse : Le développement et l’introduction du sirolimus (rapamycine), un médicament immunosuppresseur, destiné à prévenir le rejet d’organe après une transplantation, a été l’un des principaux moteurs de l’introduction de la HPLC-MS/MS dans les laboratoires cliniques. Méthode moderne HPLC-MS/MS permet la détermination simultanée du tacrolimus, du sirolimus, de la cyclosporine, de l'évérolimus et de l'acide mycofénoïque.

La HPLC-MS/MS est également utilisée pour l’analyse de médicaments cytotoxiques, antirétroviraux, d’antidépresseurs tricycliques, d’anticonvulsivants et d’autres médicaments nécessitant un dosage individuel.

La méthode HPLC-MSMS permet la séparation et la quantification des énantiomères R et S de la warfarine dans la plage de concentrations de 0,1 à 500 ng/ml.

Stupéfiants et analgésiques : La HPLC-MS/MS est largement utilisée pour l’analyse de ces composés en raison de la facilité de préparation des échantillons et du temps d’analyse court. La méthode est actuellement utilisée dans les laboratoires cliniques pour détecter la présence d’un large éventail de médicaments. La spécificité et la sensibilité uniques de la méthode permettent d’analyser simultanément plus de 500 composés de différentes classes dans un seul échantillon avec une préparation minimale de l’échantillon. Ainsi, dans le cas d’une analyse d’urine, une simple dilution de l’échantillon de 50 à 100 fois suffit. Lors de l’analyse des cheveux, au lieu d’une touffe de 100 à 200 cheveux, un seul cheveu suffit pour identifier de manière fiable les faits liés à la consommation de drogues.

Endocrinologie et analyse des stéroïdes : La HPLC-MS/MS est largement utilisée dans de nombreux laboratoires d'endocrinologie pour l'analyse des stéroïdes - testostérone, cortisol, aldestérone, progestérone, estriol et bien d'autres.

De plus en plus de laboratoires commencent à utiliser la HPLC-MS/MS pour déterminer les taux sanguins de vitamines D3 et D2.

I. Détermination des stéroïdes (profil des stéroïdes).

Les laboratoires hospitaliers et cliniques ont désormais la capacité d’effectuer la détermination simultanée de plusieurs stéroïdes par HPLC/MS/MS. Dans ce cas, il n’est pas nécessaire d’avoir un grand volume d’échantillon, ce qui est particulièrement important lors de l’analyse d’échantillons pédiatriques.

Cas dans lesquels il est conseillé de déterminer plusieurs stéroïdes (profils) :
• L'hyperplasie surrénalienne congénitale (CAH) est une anomalie congénitale de la biosynthèse des stéroïdes. Il s'agit d'un groupe de maladies héréditaires causées par une activité inappropriée des enzymes dans le cortex surrénalien, ce qui entraîne une diminution de la production de cortisol. Pour un diagnostic fiable de NAS, il est recommandé de mesurer le cortisol, l'androstènedione et la 17-hydroxyprogestérone. HPLC/MS/MS permet une quantification précise des trois stéroïdes en une seule analyse avec une confiance de 100 %.
• Le dépistage néonatal de routine à l’aide de tests immunologiques se caractérise par un taux élevé de résultats positifs et faussement négatifs. La détermination par HPLC/MS/MS non seulement du cortisol, mais aussi de l'aldostérone et du 11-désoxycortisol permet de distinguer l'insuffisance surrénalienne primaire de l'insuffisance surrénalienne secondaire.
• HPLC/MS/MS permet la détermination des stéroïdes dans la prostatite et le syndrome de douleur pelvienne chronique.
• La HPLC-MS/MS peut déterminer les profils stéroïdiens et identifier les causes de la puberté précoce liée au cortex surrénalien chez les jeunes enfants. Il a été constaté que les concentrations de testostérone, d'androstènedione, de déhydroépiandrostérone (DHEA) et de son sulfate chez ces enfants étaient légèrement plus élevées que chez les enfants témoins plus âgés.
• Le sérum des fumeurs actifs, des fumeurs passifs et des non-fumeurs est analysé pour détecter la présence de 15 hormones stéroïdes et hormones thyroïdiennes afin d'étudier la relation entre l'exposition à la fumée du patient et les concentrations d'hormones.
• La HPLC/MS/MS est utilisée dans le profilage de certaines hormones stéroïdes féminines dans l’urine.
• HPLC/MS/MS a été utilisé pour évaluer les concentrations d’hormones neuroactives pour la prévention de la neuropathie diabétique.

II. Détermination des hormones thyroïdiennes

Les méthodes de routine pour déterminer les hormones thyroïdiennes reposent généralement sur des dosages radio-immunologiques, qui sont coûteux et détectent uniquement les T3 et T4, ce qui peut limiter la capacité à déterminer et à réguler complètement la fonction thyroïdienne.

• Actuellement, par HPLC-MSMS, l'analyse simultanée de cinq hormones thyroïdiennes dans des échantillons de sérum est réalisée, dont la thyroxine (T4), la 3,3′,5-triiodothyronine (T3), la 3,3′,5′- (rT3). , 3,3'-diiodothyronine (3,3'-T2) et 3,5-diiodothyronine (3,5-T2) dans la plage de concentrations de 1 à 500 ng/ml.
• La méthode HPLC/MS/MS est également utilisée pour analyser la composition hormonale chez les patients ayant subi une thyroïdectomie. Les niveaux de concentration de thyroxine (T4), de triiodothyronine (T3), de T4 libre et de thyréostimuline (TSH) après la chirurgie sont déterminés. La HPLC/MS/MS s’est avérée être un excellent moyen d’établir la relation entre les concentrations de TSH et d’hormones thyroïdiennes.
• La méthode HPLC/MS/MS a été utilisée pour déterminer la thyroxine (T4) dans la salive et le sérum humains. La méthode se caractérise par une reproductibilité élevée, une précision et une limite de détection de 25 pg/ml. Des études ont montré qu'il existe une relation diagnostique entre les concentrations salivaires de T4 entre les sujets euthyroïdiens et les patients atteints de la maladie de Basedow.

La méthode HPLC/MS/MS possède désormais la sensibilité, la spécificité et la précision requises pour la détermination fiable de tous les stéroïdes dans les fluides biologiques et améliore ainsi les capacités de diagnostic, notamment dans le cas de la détermination d'ensembles de stéroïdes.

III. Dosage de la 25-hydroxyvitamine D par HPLC/MS/MS

La 25-hydroxyvitamine D (25OD) est la principale forme circulante de la vitamine D et le précurseur de sa forme active. (1,25-dihydroxyvitamine D). En raison de sa longue demi-vie, la détermination de la 25OD est importante pour déterminer l'état de la vitamine D dans l'organisme du patient. La vitamine D existe sous deux formes : la vitamine D3 (cholécalciférol) et la vitamine D2 (ergocalciférol). Les deux formes sont métabolisées en leurs formes respectives 25OD. La disponibilité de méthodes analytiques capables de déterminer les deux formes de vitamine avec une grande précision et de permettre le suivi des patients présentant une carence en vitamine D est d'une grande importance pour le diagnostic. Les méthodes utilisées jusqu'à présent ne permettaient pas de déterminer séparément les vitamines D2 et D3. De plus, à des concentrations élevées de vitamine D2, la quantité détectable de D3 est sous-estimée. Un autre inconvénient est l'utilisation d'isotopes radioactifs. L'utilisation de la méthode HPLC/MS/MS a permis non seulement d'éviter l'utilisation d'isotopes radioactifs, mais également de réaliser un dosage séparé des deux formes actives de la vitamine.

La méthode est applicable pour les patients suivants :
1. Si vous soupçonnez un faible niveau de vitamine D dans le corps ;
2. Si une toxicité inexpliquée est suspectée ;
3. Lors de l’examen de patients sous traitement pour de faibles niveaux de vitamine D ;
4. L'utilisation de HPLC/MS/MS a permis une détermination séparée des deux formes lors du suivi des patients.

IV. Détermination des immunosuppresseurs par HPLC/MS/MS

Après une transplantation d'organe, les médicaments immunosuppresseurs doivent être pris à vie pour éviter le rejet. Avec une marge thérapeutique très étroite et une toxicité élevée, les immunosuppresseurs nécessitent un dosage individuel pour obtenir un effet maximal. Par conséquent, la surveillance des principaux médicaments immunosuppresseurs : cyclosporine A, tacrolimus, sirolimus et évérolimus est essentielle pour ajuster la dose de médicaments pour chaque patient en fonction de la concentration du médicament dans le sang.

Les immunoessais sont encore utilisés pour surveiller ces médicaments, mais ces méthodes sont coûteuses et ont une spécificité, une précision et une reproductibilité limitées. Il existe des cas de décès de patients dus à un dosage incorrect d'immunosuppresseurs sur la base des résultats obtenus à l'aide de méthodes immunologiques. Actuellement, les tests immunologiques sont remplacés dans les laboratoires cliniques par la HPLC/MS/MS. Ainsi, à la Clinique universitaire de Munich, environ 70 échantillons sont analysés quotidiennement pour déterminer la teneur en sirolimus et en cyclosporine A à l'aide d'un système HPLC/MS/MS. Toute la préparation des échantillons et le contrôle des instruments sont effectués par un seul employé. Le laboratoire passe également aux tests du tacrolimus en utilisant cette méthode.

• L'utilisation de HPLC/MS/MS pour la détermination simultanée de routine du tacrolimus, du sirolimus, de l'ascomycine, du déméthixisirolimus, de la cyclosporine A et de la cyclosporine G dans le sang est décrite. La plage déterminée par la concentration est de 1,0 à 80,0 ng/ml. Pour la cyclosporine 25 - 2000 ng/ml. Au cours de l'année, le laboratoire a analysé plus de 50 000 échantillons.
• Étant donné que l'utilisation simultanée du tacrolimus et du sirolimus s'est avérée avoir un effet thérapeutique positif, une méthode HPLC/MS/MS simple et efficace pour leur détermination séparée dans le sang à des fins d'analyse clinique a été développée. L'analyse d'un échantillon prend 2,5 minutes avec une précision allant de 2,46 % à 7,04 % pour le tacrolimus et de 5,22 % à 8,30 % pour le sirolimus pour l'ensemble de la courbe analytique. La limite inférieure de détection du tacrolimus est de 0,52 ng/ml, pour le sirolimus de 0,47 ng/ml.

V. Dosage de l'homocystéine par HPLC/MS/MS

L'homocystéine présente un intérêt dans les maladies cardiovasculaires (thromboembolie, maladies cardiaques, athérosclérose) et d'autres pathologies cliniques (dépression, maladie d'Alzheimer, ostéoporose, complications de grossesse, etc.). Les méthodes actuelles d’analyse de l’homocystéine, y compris les tests immunologiques, sont coûteuses. Une méthode rapide HPLC/MS/MS pour l’analyse de l’homocystéine a été développée pour une utilisation clinique de routine dans l’analyse d’un grand nombre d’échantillons. L'ionisation a été réalisée par méthode d'électrospray. La méthode est reproductible, hautement spécifique et précise. Les avantages de la méthode sont également le faible coût des réactifs et la facilité de préparation des échantillons. Il est possible d'analyser 500 échantillons ou plus par jour.

Conclusion

Il convient de noter que même si des méthodes de dosage immunologique considérablement améliorées sont désormais utilisées, en raison de limitations techniques fondamentales, cette méthode n’aura jamais la précision et la spécificité pour la substance cible comparables à la HPLC-MSMS, notamment en présence de métabolites. Cela conduit non seulement à une faible précision de la méthode ELISA et à un pourcentage élevé de résultats faussement positifs et faussement négatifs, mais ne permet pas non plus de comparer les résultats obtenus dans différents services cliniques utilisant la méthode ELISA. L'utilisation de HPLC-MS/MS élimine cet inconvénient et permet une analyse hautement spécifique, précise et rapide d'un grand nombre d'échantillons avec une grande fiabilité en présence de métabolites et en l'absence d'interférence de substances concomitantes et endogènes présentes dans le plasma et le sang. de patients.

Malgré le coût apparemment élevé du complexe d'instruments, comme le montre pratique mondiale, avec un bon fonctionnement, ce complexe s'amortit en 1 à 2 ans. Cela est dû tout d'abord au faible coût d'une analyse grâce à l'analyse simultanée de dizaines et de centaines de composés et à l'absence de nécessité d'acheter des kits de diagnostic coûteux. De plus, le laboratoire a la possibilité de développer de manière indépendante toutes les méthodes d'analyse nécessaires et de ne pas dépendre du fabricant du kit.

Sélection de la configuration d'instrumentation correcte

Il existe un grand nombre de méthodes de spectrométrie de masse et de types de spectromètres de masse conçus pour résoudre une grande variété de problèmes - de l'identification structurelle de macromolécules protéiques complexes pesant des centaines de milliers de daltons à l'analyse quantitative de routine à haut débit de petites molécules.

Pour solution réussie Compte tenu de la tâche à accomplir, l’une des principales conditions est le choix du bon type d’équipement. Il n'existe pas d'appareil universel permettant de résoudre l'ensemble des problèmes analytiques. Ainsi, un dispositif conçu pour résoudre le problème de l'identification des micro-organismes n'est pas capable d'effectuer une analyse quantitative de petites molécules. Et vice versa. Le fait est que, malgré Nom commun, ce sont des appareils complètement différents fonctionnant selon des principes physiques différents. Dans le premier cas, il s'agit d'un spectromètre de masse à temps de vol avec une source d'ionisation laser - MALDI-TOF, et dans le second - d'un triple quadripôle avec ionisation par électrospray - HPLC-MSMS.

Le deuxième paramètre le plus important est le choix de la configuration correcte du système. Il existe plusieurs grands fabricants d’équipements de spectrométrie de masse. Les appareils de chaque fabricant ont non seulement leurs propres points forts, mais aussi des points faibles, qu'ils préfèrent généralement garder sous silence. Chaque fabricant produit sa propre gamme d'appareils. Le coût d'un complexe analytique varie de 100 000 à 1 000 000 de dollars ou plus. Choisir le fabricant optimal et la configuration correcte de l'équipement permettra non seulement d'économiser des ressources financières importantes, mais résoudra également la tâche plus efficacement. Malheureusement, il existe de nombreux exemples où des équipements de laboratoire ont été réalisés sans tenir compte de ces facteurs. Le résultat est un équipement inutilisé et un gaspillage d’argent.

Le troisième facteur déterminant le succès du fonctionnement d’un laboratoire est le personnel. Le fonctionnement des spectromètres de masse nécessite un personnel hautement qualifié. Malheureusement, aucune université en Russie ne propose de cours de spectrométrie de masse pratique moderne, notamment en ce qui concerne les applications cliniques, et les tâches de formation du personnel dans chaque laboratoire doivent être résolues de manière indépendante. Naturellement, 2 à 3 jours de formation d'introduction dispensée par le constructeur après le lancement de l'équipement ne suffisent absolument pas pour comprendre les bases de la méthode et acquérir des compétences dans le fonctionnement de l'appareil.

Le quatrième facteur est le manque de méthodes d’analyse toutes faites. Chaque laboratoire a ses propres tâches prioritaires, pour lesquelles il est nécessaire de développer ses propres méthodes. Cela peut être fait par une personne possédant au moins 2 à 3 ans d'expérience dans l'utilisation de l'appareil. Les fabricants proposent parfois une ou deux méthodes générales à caractère de recommandation, mais ne les adaptent pas aux tâches spécifiques du laboratoire.

DANS BioPharmExpert LLC Nous employons des spécialistes possédant de nombreuses années d'expérience travaillant sur différents types de spectromètres de masse, ainsi que dans le développement de méthodes et la réalisation d'analyses à haut débit. C'est pourquoi nous proposons les services suivants :

1. Sélection de la configuration optimale de l’appareil pour les tâches spécifiques du client.
2. Achat, fourniture et lancement d'équipements auprès des principaux fabricants de spectromètres de masse tandem.Formation étape par étape du personnel dans un délai d'un an à compter de la date de lancement de l'équipement.
3. Un ensemble de techniques et de bases de données prêtes à l'emploi pour résoudre des problèmes cliniques de base.
4. Développement de méthodes d'analyse et résolution de problèmes spécifiques du client dans son laboratoire avec l'implication de son personnel.
5. Accompagnement méthodologique à toutes les étapes du travail.