SPEZIELLE (WAHL-)ERNÄHRUNGSMEDIEN

Hefe-Wachstumsmedien

Synthetisches Lesemedium

Die Zusammensetzung des Mediums umfasst, g/l: Ammoniumsulfat 3, Magnesiumsulfat 0,7, Calciumnitrat 0,04, Natriumchlorid 0,5, Kaliumdihydrogenphosphat 1,0, Kaliumhydrogenphosphat 0,1. Anfangs-pH-Wert 6,6. Calciumnitrat, das von Hefen nicht verwendet wird, kann im Medium weggelassen werden. Um die Hefereproduktion zu untersuchen, fügen Sie 2 % Zucker hinzu, um die Fermentation zu untersuchen – 5-10 %. Das komplette synthetische Medium enthält kristalline Vitamine, mcg/ml: Inositol 5, Biotin 0,0001, Pantothensäure 0,25, Thiamin 1,0, Pyridoxin 0,25, Nikotinsäure 0,5. Sterilisieren Sie das Medium in einem Autoklaven bei einem Druck von 0,1 M Pa für 20 Minuten.

Glucose-Ammonium-Medium

Enthält in 1 Liter Leitungswasser folgende Stoffe, g: Ammoniumsulfat 5, Kaliumdihydrogenphosphat 0,85, Kaliumhydrogenphosphat 0,15, Magnesiumsulfat 0,5, Natriumchlorid 0,1, Calciumchlorid 0,1, Glucose 20, Agar 20 Zur Anreicherung mit Wachstumsfaktoren, Hefeextrakt (0,2 %) oder Fleischextrakt (0,3 %) und Traubensaft werden hinzugefügt.

Synthetisches Medium zur Identifizierung unvollständiger Hefen

Enthält in 1 Liter Leitungswasser folgende Stoffe, g/l: Glucose 50, Lysin 3, Kaliumdihydrogenphosphat 1, Magnesiumsulfat 1, Eisensulfat – Spuren. Jede Komponente wird separat in Wasser gelöst und in der angegebenen Reihenfolge hinzugefügt. Dem Medium wird Agar (1,5 %) zugesetzt, geschmolzen, in Reagenzgläser gegossen und 20 Minuten bei einem Druck von 0,05 MPa sterilisiert.

Komplettmedium mit Lysin zum Nachweis unvollständiger Hefen

Enthält in 1 Liter Leitungswasser die folgenden Stoffe, g/l: Glucose 50, Magnesiumsulfat 1, Kaliumdihydrogenphosphat 2, Kaliumlactat 12 ml (50 %ige Lösung), /, (+) Lysinmonohydrat 1, Vitaminlösung (per 100 ml steriles destilliertes Wasser hinzufügen, g: Inositol 2, Calciumpantothenat 0,4, Nicotinamid 0,5, Hydratamin 0,1, Agar 20; pH-Wert des Mediums – 5–5,2. Das Medium wird in 15-ml-Reagenzgläser gegossen und 15 Minuten lang bei sterilisiert einem Druck von 0,1 MPa.

Acetatmedium zum Nachweis unvollständiger Hefen

Für 1 Liter Leitungswasser nehmen Sie 10 g Natriumacetat, 10 g Ammoniumchlorid, 5 g Glucose, 3 ml Hefeautolysat, gießen Sie in 5-ml-Reagenzgläser und sterilisieren Sie es 30 Minuten lang bei einem Druck von 0,05 MPa.

Medium zur Identifizierung fremder Hefen, die der Hauptkultur morphologisch ähnlich sind

10 g Pepton, 2 g Kaliumhydrogenphosphat werden in 500 ml destilliertem Wasser gelöst und filtriert. Im Filtrat werden 15 g Agar geschmolzen, 10 g Glucose, 0,4 g Eosin und 0,065 ml Methylenblau (90 %ige Alkohollösung) zugegeben, mit heißem destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt, in Reagenzgläser gegossen und sterilisiert 15 Minuten bei einem Druck von 0,1 MPa. Beim Sterilisieren verschwindet die Farbe, beim Abkühlen erscheint sie wieder. Das Medium wird maximal 2 Monate gelagert.

Medium zur Pseudomyzelbildung

Glucose-Pepton-Agar. Zu 1 Liter Leitungswasser hinzufügen: Pepton 10, Glucose 20, Agar 30-35. 30 Minuten lang bei einem Druck von 0,05 MPa sterilisieren. Bei Bedarf können Sie Hefe oder Fleischextrakt (0,5 %) hinzufügen oder in flüssiger Form kochen.

Kartoffelagar. 100 g geschälte, gewaschene, in dünne Scheiben geschnittene Kartoffeln werden an einem kühlen Ort mehrere Stunden lang mit 300 ml Leitungswasser aufgegossen. Der Extrakt wird filtriert, 230 ml des Extrakts werden mit Leitungswasser auf 1 Liter aufgefüllt, 20 g Glucose und 30-35 g Agar werden zugegeben, geschmolzen und 1 Stunde bei einem Druck von 0,075 MPa sterilisiert.

Hefewasser mit Kohlenhydraten („Farbreihe“)

Die Fähigkeit der Hefe, Kohlenhydrate zu fermentieren, wird anhand von Hefewasser mit 2 % des Testzuckers (Glukose, Maltose, Saccharose, Laktose, Raffinose usw.) bestimmt. Das Medium wird in Reagenzgläser mit Schwimmern, Dunbar-Röhrchen, gegossen und mit fraktioniertem Dampf sterilisiert. Die Ergebnisse nach der Aussaat werden nach 2 Tagen, ggf. nach 7 Tagen Kultivierung bei einer Temperatur von 30 °C erfasst.

Die Fähigkeit von Hefen, Kohlenhydrate durch Oxidation zu verstoffwechseln, wird auf einem Medium der folgenden Zusammensetzung untersucht, r/l: Ammoniumsulfat 5, Kaliumdihydrogenphosphat 1, Magnesiumsulfat 0,5, Autolitat 1, Testzucker 10, Agar 20. Das Medium wird gegossen in Reagenzgläser füllen, 30 Minuten bei einem Druck von 0,05 MPa sterilisieren, Schrägagar vorbereiten. Das Kulturwachstum wird nach 3–4 Tagen beurteilt.

Hefeagar mit Zucker

0,5 % Natriumchlorid, 1 % Glucose (oder 4 oder 10 % Saccharose) und 2 % Agar werden in Hefewasser gelöst, pH 6,8 (mit Glucose) und 6-6,5 (mit Saccharose). Das Medium wird in Reagenzgläser oder Kolben gegossen und 30 Minuten lang bei einem Druck von 0,05 MPa sterilisiert.

Antibiotika-Medien

Zur bevorzugten Entwicklung von Hefen und zur Unterdrückung begleitender Bakterien werden Breitbandantibiotika in die Medien eingebracht: Streptomycin (100 Einheiten/ml), Penicillin (20-100 Einheiten/ml), Levomycin (50 mg/l), Neomycin ( 20 Einheiten/ml) usw. Sie können der Umgebung entweder zusammen oder getrennt zugesetzt werden.

Medien zur Ascosporenbildung

Mittwoch Gorodkova. Enthält in 1 Liter Leitungswasser, g: Pepton 10, Natriumchlorid 5, Glucose 1 (oder 2,5), Agar 20; Der pH-Wert der Umgebung beträgt 7,3. In Reagenzgläser füllen und 15 Minuten bei einem Druck von 0,1 MPa sterilisieren.

McClary-Acetat-Agar. Zu 1 Liter destilliertem Wasser geben Sie Folgendes hinzu: Natriumacetat 8,2, Kaliumchlorid 1,8, Glucose 1, Hefeextrakt 2,5, Agar 15. Autoklavieren Sie 15 Minuten lang bei einem Druck von 0,1 MPa.

Mittwoch Starkey. In 1 Liter Leitungswasser auflösen: Kaliumhydrogenphosphat 1, Kaliumdihydrogenphosphat 0,25, Magnesiumsulfat 0,25, Calciumchlorid 0,05, Agar 20. 15 Minuten lang bei einem Druck von 0,05 MPa sterilisieren.

Osmophiles Hefewachstumsmedium

Zu 1 Liter Glukosesirup (50-60 % TS) 5 g Pepton und 20 g Agar hinzufügen. Pepton kann durch Hefewasser (50 ml) ersetzt werden. Bei einem Druck von 0,05 MPa sterilisieren.

Melassewürze

200-300 g dicke Melasse werden im Verhältnis 1:3 mit Wasser vermischt, auf eine Temperatur von 95 °C erhitzt und 2 Stunden stehen gelassen. Dabei setzen sich die koagulierten Kolloide ab und die Melasselösung wird geklärt. Der Lösung werden 3 % Diammoniumphosphat zugesetzt, mit Wasser auf 5–8 % TS verdünnt und in Reagenzgläser oder Kolben gegossen. Um ein Agarmedium herzustellen, fügen Sie 1,5–2 % Agar hinzu. Bei einem Druck von 0,05 MPa 30 Minuten lang in einem Autoklaven oder fraktioniert 1 Stunde lang im Abstand von 20-24 Stunden dreimal sterilisieren.

Medien zur Züchtung von Fadenpilzen

Rüben-Agar

Gut gewaschene Zuckerrüben werden in Scheiben geschnitten, mit Leitungswasser (20 g Rüben pro 1 Liter Wasser) aufgefüllt und 30 Minuten gekocht. Das Filtrat wird mit Wasser auf das ursprüngliche Volumen gebracht, mit 2 % Agar versetzt und bei einem Druck von 0,1 MPa 30 Minuten lang sterilisiert.

Rübenschnitzel

Saubere Rüben werden auf einer Reibe gemahlen, in Petrischalen gegeben und ohne Umdrehen 30 Minuten lang bei einem Druck von 0,1 MPa sterilisiert.

Mittwoch Capek

Zusammensetzung des Mediums, g/l: Saccharose oder Glucose 30, Kaliumdihydrogenphosphat 1,0, Natriumnitrat 2,0, Magnesiumsulfat 0,5, Kaliumchlorid 0,05, Eisensulfat 0,1, Agar 20. Eine Agarprobe wird ausgelaugt und zuvor mit diesen Zutaten versetzt In 1 Liter destilliertem Wasser gelöst, unter fließendem Dampf erhitzt und der pH-Wert mit einer 10 %igen Lösung von Zitronensäure oder Natriumhydroxid auf 4,0–5,5 eingestellt. Filtrieren, in Reagenzgläser füllen und im Abstand von 1 Tag dreimal für 30 Minuten mit fraktioniertem Dampf sterilisieren.

Czapek-Dox-Zuckernitrat-Agar

Variante 1. Für 1 Liter destilliertes Wasser nehmen Sie g: Saccharose 20, Kaliumhydrogenphosphat 0,5, Magnesiumsulfat 0,5, Natriumchlorid 0,5, Kaliumnitrat 1, Spuren von Eisensulfat, Calciumcarbonat 2-5, Agar 20.

Möglichkeit 2. Für 1 Liter destilliertes Wasser nehmen Sie, g/l: Saccharose 30, Ammoniumnitrat 2,5, Kaliumdihydrogenphosphat 1, Magnesiumsulfat 1, Eisensulfat 0,01, Agar 20.

Glucose-Stärke-Medium

Die gleichen Salzbestandteile wie im Saccharose-Nitrat-Agar von Czapek, jedoch werden anstelle von Saccharose 25 g lösliche Stärke und 5 g Glucose verwendet.

Stärke-Ammonium-Agar

Zusammensetzung des Mediums, g/l: lösliche Stärke 10, Calciumcarbonat 3, Kaliumhydrogenphosphat 1, Magnesiumsulfat 1, Natriumchlorid 1, Ammoniumsulfat 1, Agar 20. 30 Minuten lang bei einem Druck von 0,05 MPa sterilisieren.

Mittwoch Saburo

Zu 100 ml sterilem Hefewasser g hinzufügen: Pepton 5, Glucose 4, Agar 1,8-2. 20 Minuten lang bei einem Druck von 0,05 MPa oder teilweise sterilisieren.

Die Basis dieses Mediums ist Hefewasser. Zur Herstellung von Hefewasser werden 70–100 g frisch gepresste Hefe (7–10 g Trockenhefe) 20–30 Minuten in 1 Liter destilliertem Wasser gekocht und 12 Stunden in einem hohen Zylinder in der Kälte belassen Flüssigkeit wird dekantiert, nochmals 1,1 l Wasser zugegeben, 30 Minuten kochen, filtrieren, pH-Wert auf den gewünschten Wert einstellen. Das vorbereitete Medium wird in 2-3-Minuten-Schritten von 20 Minuten im Abstand von 1 Tag sterilisiert. Zu 100 ml sterilem Hefewasser 1 % Pepton, 2 % Agar hinzufügen, nach dem Auflösen des Agars 4 % Glucose oder Maltose hinzufügen, filtrieren, in Reagenzgläser füllen und 20 Minuten bei einem Druck von 0,05 MPa sterilisieren.

Das Medium kann auch mit normalem 1 % Peptonwasser zubereitet werden.

Medien zur Züchtung von Milchsäurebakterien

Hydrolysierte Milch (nach Bogdanov)

Normale oder Magermilch (pH 7,6-7,8) wird 5 Minuten lang gekocht, das Gefäß wird gründlich geschüttelt und auf eine Temperatur von 45 °C abgekühlt und 0,5-1 g Pankreatin pro 1 Liter hinzugefügt, nach 4-7 Minuten 5 hinzufügen ml Chloroform. 18–20 Stunden bei einer Temperatur von 40 °C in einen Thermostat stellen. Pankreatinpulver sollte in einer kleinen Menge warmem Wasser vorverdünnt werden. In den ersten Stunden wird die Milch mehrmals bei geöffnetem Stopfen umgerührt. Hydrolysierte Milch wird durch einen Papierfilter filtriert, 2-3 mal mit Wasser verdünnt, der pH-Wert auf 7,0-7,2 eingestellt und 15 Minuten bei einem Druck von 0,1 MPa oder 20 Minuten bei einem Druck von 0,05 MPa sterilisiert.

Hydrolysiertes Milchagar

Der hydrolysierten Milch werden 1,5–2,0 % Agar zugesetzt. Die Mischung wird zum Kochen gebracht und so lange gehalten, bis sich das Agar vollständig aufgelöst hat. Das heiße Medium wird durch einen Baumwollfilter filtriert, in Reagenzgläser oder Kolben gegossen und bei einem Druck von 0,1 MPa 10–15 Minuten lang sterilisiert.

Magermilch mit Indikator

Frische, zum Kochen gebrachte Magermilch wird heiß mit Lackmustinktur zu einem intensiven Lilaton gefärbt. Sterilisieren Sie mit fließendem Dampf (3-mal für 30 Minuten im Abstand von 1 Tag) oder durch 10-minütiges Autoklavieren bei einem Druck von 0,1 MPa.

Malzwürze mit Treber

Es wird Malzwürze hergestellt, jedoch ohne Abtrennung des Trebers (12-15 % TM). In Reagenzgläser füllen, sterile Kreide (2-4 %) hinzufügen und 30 Minuten bei einem Druck von 0,05 MPa sterilisieren.

Hefe-Saccharose-Agar

Zu identifizieren Lactobacillus Und Leuconostoc Verwenden Sie ein Medium, das auf der Basis von Hefewasser unter Zusatz von 0,5 % Natriumchlorid, 10 % Saccharose und 2 % Agar hergestellt wurde; Der pH-Wert der Umgebung beträgt 6–6,5.

Keimmedium

25 g Malzsprossen (Gerstensprossen) werden 10 Minuten lang mit 500 ml Wasser gekocht und nach dem Abkühlen auf eine Temperatur von 45–50 °C durch einen Leinenbeutel filtriert, mit geschlagenem Hühnereiweiß geklärt, erneut gekocht und durch einen Filter filtriert Papierfilter zur Entfernung von geronnenem Protein. Der Lösung werden 1,5 % Pepton, 2 % Zucker, 2 % Agar zugesetzt und 30 Minuten bei einem Druck von 0,05 MPa sterilisiert.

Kohl Mittwoch

200 g gehackter Weißkohl werden in 1 Liter Wasser gegossen, 10 Minuten gekocht und durch zwei Lagen Gaze gepresst. Die resultierende Flüssigkeit wird durch einen Faltenfilter filtriert, 2-fach verdünnt und dem Sud werden 2 % Glucose und 1 % Pepton zugesetzt. In Reagenzgläser füllen und 15 Minuten bei einem Druck von 0,05 MPa sterilisieren. Um ein festes Medium zu erhalten, fügen Sie 2 % Agar hinzu.

MRS-Medium (De-Man-Medium)

Die Zusammensetzung des Mediums umfasst, g/l: Mangansulfat 0,05, Magnesiumsulfat 0,2, Kaliumhydrogenphosphat 2, Ammoniumnitrat 2, Natriumacetat 5, Pepton 10, Difko-Hefeextrakt 5, Fleischextrakt 10, Glucose 20, Tween-80 1 ml, mittlerer pH-Wert 6–6,5. Das Medium wird filtriert und in Teilschritten von 30 Minuten dreimal im Abstand von 1 Tag oder in einem Autoklaven bei einem Druck von 0,05 MPa für 20 Minuten sterilisiert. Wird in flüssiger, halbflüssiger und Agarform zur Geburt verwendet Leuconostoc Und Lactobacillus.

MRS-Medien (modifiziert von A.A. Lanzier)

MRS-1-Umgebung. In 200 ml destilliertem Wasser auflösen, g: Mangansulfat 0,05, Magnesiumsulfat 0,2, Cystein 0,2, Kaliumhydrogenphosphat 2, Ammoniumcitrat 2, Natriumacetat 5, Glucose 20, Pepton 10, Tween-80 1 ml (getrennt auflösen). in einer kleinen Menge heißem destilliertem Wasser), Hefeautolysat (siehe Anhang 2) 50 ml, Leberextrakt 100 ml. Das Flüssigkeitsvolumen wird mit destilliertem Wasser auf 500 ml eingestellt und 500 ml hydrolysierte Magermilch von Bogdanov, nicht zuvor sterilisiert, pH 6,2–6,8, hinzugefügt. Das Medium wird gefiltert und mit fraktioniertem Dampf sterilisiert.

MRS-2-Umgebung. Konzipiert für die Museumslagerung von Stämmen Lactobacillus. Hergestellt auf Basis von MRS-1-Medium unter Zusatz von 0,15 % Agar. Das Ergebnis ist ein halbflüssiges Medium, das im Vergleich zu einem flüssigen Medium anaerobe Bedingungen schafft.

MRS-3-Umgebung. Konzipiert für die „bunte Serie“ zur Identifizierung von Milchsäurebakterien. Es basiert auf dem MPC-1-Medium, jedoch ohne Glukose, Leberextrakt und hydrolysierte Milch. Kohlenhydrate und mehrwertige Alkohole werden in einer Menge von 0,5 % zugesetzt. Die zugesetzte Agarmenge beträgt 0,15 %. Der pH-Wert der Umgebung beträgt 7,0. Der Indikator ist Chlorphenolrot (0,004 %). Der Indikator wird in 1-2 ml Ethylalkohol gelöst und vor der Sterilisation dem Medium zugesetzt. Chlorphenolrot ergibt im pH-Bereich von 4,8-6,4 einen Farbübergang von Rotviolett nach Gelb.

Leberextrakt

Frische Rinderleber wird fein geschnitten und mit Wasser aufgefüllt (1 kg Leber: 1 Liter Wasser). 30 Minuten kochen und filtrieren, dann 20 Minuten bei einem Druck von 0,05 MPa sterilisieren.

Mittwoch, 10

Für 1 Liter ungehopfte Bierwürze (8 % TS) oder 1 Liter Hefewasser zugeben, g: Mangansulfat 0,05, Magnesiumsulfat 0,2, Cystin oder Cystein 0,2, Kaliumhydrogenphosphat 2, Ammoniumcitrat 0,2, Natriumacetat 2,5, Saccharose 20, Pepton 10, Hefeautolysat 50 ml. Jede Komponente wird in der angegebenen Reihenfolge in Malzwürze gelöst (z Lactobacillus) oder Hefewasser (z Leuconostoc). Im ersten Fall beträgt der pH-Wert der Umgebung 5,5, im zweiten Fall 6,0. 1,5 % Agar hinzufügen und mit fließendem Dampf sterilisieren. Den Petrischalen kann sterile Kreide zugesetzt werden.

In 150 ml gefiltertem Tomatensaft 0,75 ml Tween-80 und 37,5 g Glucose unter Erhitzen auflösen, 5 ml Hefeautolysat, 600 ml Magermilch (Magermilch) und 150 ml geschmolzenes 2 % Fleisch-Pepton-Agar hinzufügen . Der pH-Wert wird auf 7,0 eingestellt. Das Medium wird in Reagenzgläser von 6–7 ml gegossen, 20 Minuten lang bei einem Druck von 0,05 MPa sterilisiert, abgekühlt, mit den untersuchten Milchsäurebakterien beimpft und 1–2 ml geschmolzener 2 % Fleisch-Pepton-Agar darüber geschichtet . Bei schwacher Gasbildung wird der Pfropfen vom Hauptmedium getrennt, bei starker Gasbildung steigt er hoch oder fliegt aus dem Reagenzglas.

Medien zur Züchtung schleimbildender Bakterien

Variante 1. Fleisch-Fleisch-Agar mit 10 % Saccharose.

Option 2. Zusammensetzung, g/l: Rohzucker 40, Natriumhydrogenphosphat 2, Natriumchlorid 0,5, Magnesiumsulfat 0,1, Eisensulfat 0,01, Calciumcarbonat 10, Agar 20.

Mittwoch Wittenbury

Die Zusammensetzung des Mediums umfasst g/l: Fleischextrakt 5, Pepton 5, Hefeautolysat 50 (oder Hefeextrakt 50), 1,6 %ige Lösung von Bromkresolpurpur 1,4 ml, pH 6,8–7,0. Im Abstand von 1 Tag 3-mal für 45 Minuten mit strömendem Dampf sterilisieren.

Medien zur Züchtung fäulniserregender, asporogener Bakterien

Milchagar

Magermilch wird in 5-ml-Reagenzgläser gegossen und mit fließendem Dampf oder im Autoklaven 20 Minuten lang bei einem Druck von 0,05 MPa sterilisiert. Bereiten Sie separat 3 % Wasseragar vor, gießen Sie 4–5 ml in Reagenzgläser und sterilisieren Sie 30 Minuten lang bei einem Druck von 0,1 MPa. Der Agar wird geschmolzen, steril mit Milch vermischt und in Petrischalen gegossen, in die zuvor die Testprobe gegeben wurde.

Medien zur Züchtung fettverdaulicher Bakterien

Option I. Zu 1 Liter Wasser 5 g Pepton und 3 ml Hefeautolysat hinzufügen. Nachdem ein pH-Wert von 7,2–7,4 erreicht wurde, 1,5 % Agar hinzufügen. Das Agar wird geschmolzen, das Medium filtriert und 1 % heißes Milchfett oder Olivenöl hinzugefügt. Mischen, in Reagenzgläser füllen und 15 Minuten bei einem Druck von 0,1 MPa sterilisieren.

Option 2. Dem Fleischpepton-Agar werden 2–4 % Milchfett oder Olivenöl zugesetzt. 10 ml in Reagenzgläser füllen und 20 Minuten bei einem Druck von 0,1 MPa sterilisieren. Schütteln Sie das Medium gründlich, bevor Sie es in die Tassen geben.

Ein Beispiel für ein solches Medium ist Gelatine mit hydrolysierter Milch. Der hydrolysierten Milch wird 10 % Gelatine zugesetzt (Sie können hydrolysiertes Kasein oder Fleischextraktbrühe verwenden), quellen lassen und unter Rühren auf eine Temperatur von 50 °C erhitzen. Der pH-Wert der Umgebung beträgt 7,0–7,2. Das Medium wird filtriert und in Reagenzgläsern bei einem Druck von 0,075 MPa 20 Minuten lang sterilisiert.

Medien zur Züchtung von Essigsäurebakterien

4 Vol. zu Malzwürze oder Kohlmedium hinzufügen. % Ethylalkohol und 20 Einheiten/ml des Antibiotikums Monomycin, das das Wachstum von Milchsäurebakterien hemmt.

Medien für das Wachstum von Anaerobiern

Winogradsky Mittwoch. In 1 Liter destilliertem Wasser lösen Sie Folgendes auf: Kaliumhydrogenphosphat 1, Magnesiumsulfat 0,5, Mangansulfat 20, Glucose 20, Natriumchlorid und Eisenchlorid – Spuren.

Mittwoch Kita-Tarozzi. Gekochte und mit Wasser gewaschene Leber- oder Fleischstücke werden so in ein Reagenzglas getaucht, dass sie den Boden bedecken. Gießen Sie Fleisch-Pepton-Brühe mit 1 % Glucose (pH 7,2-7,4) auf "/ 2 Volumen des Reagenzglases und senken Sie den Schwimmer ab. Gießen Sie eine 1 cm hohe Schicht Vaselineöl darüber. 15 Minuten lang bei einem Druck von 0,1 sterilisieren MPa 2 mal im Abstand von 30 Min.

Medium für das Wachstum thermophiler Anaerobier, die Schwefelwasserstoff produzieren

Die Zusammensetzung des Mediums umfasst g/l: Pepton 10, Eisensulfat 1, Agar 20. Vor dem Befüllen wird ein sauberer Eisennagel in jedes Reagenzglas gegeben. Nach der Beimpfung des Zuckers wird eine Schicht sterile Vaseline in das Reagenzglas gegossen. Wenn Zucker Schwefelwasserstoff produzierende Bakterien enthält, bilden sich im Agar charakteristische schwarze Kolonien.

Je nach Verwendungszweck werden Nährmedien in die folgenden Hauptkategorien eingeteilt.

Universal- Medien, auf denen viele Arten pathogener und nicht pathogener Bakterien gut wachsen. Dazu gehören: Fleisch-Pepton-Brühe (MPB = Fleischwasser + 1 % Pepton + 0,5 % NaCl), Fleisch-Pepton-Agar (MPA = MPB + 2-3 % Agar).

Differentialdiagnose- Medien, die es ermöglichen, eine Bakterienart anhand ihrer enzymatischen Aktivität oder ihrer kulturellen Manifestationen von anderen zu unterscheiden. Dazu gehören Endo, Levin, Ploskirev, Gissa und viele andere.

Selektiv(Synonyme: selektiv, elektiv, Anreicherung) – Medien, die Substanzen enthalten, die von Mikroorganismen bestimmter Arten verwendet werden und das Wachstum anderer Mikroorganismen nicht fördern oder gar verhindern. Selektive Medien ermöglichen die gezielte Auswahl bestimmter Bakterienarten aus dem Untersuchungsmaterial. Dazu gehören Muller, Selenit, Rapoport, 1 % Peptonwasser usw.

Differentialselektiv- Umgebungen, die die Eigenschaften differenzialdiagnostischer und selektiver Umgebungen kombinieren. Sie dienen insbesondere dazu, den Nachweis und die Identifizierung von Bakterien zu beschleunigen, die zu einer Vielzahl weit verbreiteter Enterobakterien- und Pseudomonadenarten (Sivolodsky-Umfeld) gehören.

Besonders- Medien, die speziell für das Wachstum von Bakterien vorbereitet wurden, die auf Universalmedien nicht oder nur sehr schlecht wachsen. Dazu gehören McCoy-Chapin-Medium (um das Wachstum des Erregers der Tularämie zu fördern), Blut-MPA (um das Wachstum pathogener Streptokokken zu fördern), Lowenstein-Jensen-Medium (um den Erreger der Tuberkulose zu isolieren) usw.

Synthetik- Medien mit einer genau definierten chemischen Zusammensetzung, bei denen es sich um Lösungen anorganischer Salze unter Zusatz chemischer Verbindungen handelt, die als Kohlenstoff- oder Stickstoffquelle dienen. Ein Beispiel für ein solches synthetisches Medium ist das Minimalmedium M-9, in dem die Energie- und Kohlenstoffquelle Glucose und der Stickstoff NH4C1 ist. Synthetische Medien können eine komplexere Zusammensetzung haben und verschiedene Aminosäuren, Basen und Vitamine enthalten.

Halbsynthetisch- synthetische Medien, denen ein Produkt natürlichen Ursprungs zugesetzt wird, beispielsweise Blutserum. Es gibt viele verschiedene Kulturmedienoptionen, die auf die Bedürfnisse der jeweiligen Bakterienspezies und diagnostischen Zwecke zugeschnitten sind.

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Nährmedien in der Mikrobiologie sind Substrate, auf denen Mikroorganismen und Gewebekulturen wachsen. Sie werden zu diagnostischen Zwecken, zur Isolierung und Untersuchung reiner Mikroorganismenkulturen, zur Herstellung von Impfstoffen und Arzneimitteln sowie für andere biologische, pharmazeutische und medizinische Zwecke verwendet.

Klassifizierung mikrobiologischer Kulturmedien

In der Mikrobiologie werden Nährmedien unterteilt in:
- Umgebungen bestimmter und unbestimmter Zusammensetzung;
- natürlich, halbsynthetisch und synthetisch;
- Grund-, Diagnose-, Wahlfach;
- dicht, halbflüssig, flüssig, trocken, körnig.

Natürliche Nährmedien sind solche, die aus natürlichen Materialien gewonnen werden: Blut, Fleisch, Proteine, tierische Organe, Pflanzenextrakte und Pflanzenmaterialien. Beispiele für solche Medien sind Fleischbrühe, Molke, Bierwürze, Heuaufgüsse, Agar-Agar, Blut und Galle. Unter natürlichen Umgebungen versteht man Umgebungen mit ungewisser Zusammensetzung, die zu unterschiedlichen Zeiten unterschiedliche Mengen bestimmter Bestandteile aufweisen können.

Auch halbsynthetische Medien gelten als Medien ungewisser Zusammensetzung. Sie werden auf der Basis natürlicher Nährmedien hergestellt, ihnen werden jedoch Stoffe zugesetzt, die eine aktive Vermehrung der Pflanzen gewährleisten. Pflanzen werden auf halbsynthetischen Medien angebaut, um Vitamine, Aminosäuren und Antibiotika für industrielle Pharmazeutika zu produzieren.

Synthetische Medien werden aus Inhaltsstoffen bekannter Zusammensetzung in bekannten Konzentrationen und Verhältnissen hergestellt, daher gehören diese Medien zu Medien einer bestimmten Zusammensetzung. Mit ihrer Hilfe untersuchen sie den Stoffwechsel von Mikroorganismen, ihre biologischen und physiologischen Eigenschaften und die Möglichkeit, Substanzen zu gewinnen, die ihre Entwicklung unterdrücken oder umgekehrt stimulieren.

Basis-, Wahl- und Diagnosenährmedien

Basismedien werden zum Züchten verschiedener mikrobieller Kulturen sowie als Grundlage für die Gewinnung von Wahl- und Diagnosemedien verwendet. Zu den Grundmedien gehören beispielsweise Fleischbrühe, Fleischagar, Würze und Hottinger-Brühe. Für verschiedene Kulturen werden dem Grundmedium einige Komponenten zugesetzt, um das Wachstum zu stimulieren – das können Vitamine, Aminosäuren und natürliche Extrakte sein. So wird der Erreger des Keuchhustens unter Zusatz von Blut auf einem Medium gezüchtet.

Wahlmedien – Medien für den selektiven (selektiven) Anbau biologischer Nutzpflanzen. Die Zusammensetzung des Mediums wird so gewählt, dass es für eine Art oder Gruppe eng verwandter Bakterien optimal ist und die Entwicklung von Bakterien anderer Arten unterdrückt. Zum Beispiel die Zugabe von Natriumchlorid zum Medium hemmt in einer bestimmten Konzentration das Wachstum aller Bakterien außer Staphylokokken. Mit Hilfe von Wahlkulturen werden Reinkulturen zur weiteren Vermehrung und Anreicherung gewonnen.

Diagnostische Medien dienen der Identifizierung von Mikroorganismen. Anhand von Veränderungen des Mediums und seiner chemischen Zusammensetzung (Änderungen der Farbe des Mediums, Auftreten von Gasblasen usw.) wird die Art der Bakterien bestimmt. Solchen Medien werden häufig chemische Indikatorfarbstoffe wie Kristallviolett, Malachitgrün, Methylenblau, Fusin und andere zugesetzt. Sie tragen dazu bei, nahestehende Kulturen zu trennen. Beispielsweise bildet E. coli im rosafarbenen Endo-Medium, das mit Fusin getönt ist, rote Kolonien, und Typhus- und Ruhrbakterienkolonien sind farblos.

Nährmedien dienen der Anreicherung, Isolierung, Untersuchung und Konservierung von Mikroorganismen. Bei der Herstellung künstlicher Nährmedien werden sowohl die Bedürfnisse der Mikroorganismen nach lebensnotwendigen Stoffen als auch die physikalisch-chemischen Bedingungen berücksichtigt, unter denen sie zwischen Zelle und Umwelt austauschen können.

Um einen vielfältigen mikrobiellen Stoffwechsel zu gewährleisten, müssen Nährmedien die folgenden Anforderungen erfüllen.

• 1. Enthalten alle Elemente, aus denen die Zelle aufgebaut ist: Makroelemente (Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, Phosphor, Kalium, Kalzium, Magnesium, Eisen) und Mikroelemente (Mangan, Molybdän, Zink, Kupfer, Kobalt, Nickel, Vanadium, Chlor, Natrium, Silizium usw.). Alle Elemente müssen in Verbindungen vorliegen, die von einem bestimmten Mikroorganismus verdaut werden können. Die Kohlenstoffquelle kann eine Vielzahl organischer Verbindungen sein: Kohlenhydrate, mehrwertige Alkohole, organische Säuren, Aminosäuren, Proteine ​​​​usw. Die Stickstoffquelle sind Ammoniumverbindungen, Aminosäuren, Peptide, Proteine. Die Quelle der übrigen Makroelemente sind anorganische Verbindungen – Salze von Phosphorsäure und anderen Säuren. Mikroelemente gelangen mit organischen Substraten, Salzen und Wasser in das Nährmedium. Vitamine (insbesondere Gruppe B) und andere Wachstumsfaktoren werden dem Medium als Bestandteil organischer Substrate oder in Form reiner Substanzen zugesetzt.
• 2. Sorgen Sie für ausreichende Luftfeuchtigkeit (mindestens 20 % Wasser).
• 3. Die Salzkonzentration im Medium muss die Isotonie gewährleisten, d.h. entsprechen der Salzkonzentration in der mikrobiellen Zelle (für die meisten Mikroorganismen - 0,5 %; halophil - 3 %).
• 4. Die Konzentration der Wasserstoffionen (pH) des Mediums muss für den zu züchtenden Mikroorganismus optimal sein (pH-Bereich 4,5–8,5).
• 5. Das Redoxpotential (Eh) des Mediums muss den Bedürfnissen des Mikroorganismus entsprechen: für Anaerobier – 0,120–0,060 V, für Aerobier – mehr als 0,080 V.
• 6. Das Nährmedium muss steril sein.

Die Zusammensetzung von Nährmedien kann synthetisch oder natürlich sein. Nährmedien sind synthetisch, wenn sie nur chemisch reine Verbindungen in vorgeschriebenen Dosierungen enthalten, d. h. ihre Zusammensetzung ist vollständig bekannt. Der Vorteil solcher Umgebungen liegt in der Standardisierung und Reproduzierbarkeit. Allerdings stehen synthetische Medien nur für wenige pathogene Bakterien zur Verfügung. Sie werden hauptsächlich für experimentelle Untersuchungen des mikrobiellen Stoffwechsels verwendet.

Natürliche Umgebungen werden häufig für die praktische Forschung genutzt. Natürliche (natürliche) Nährmedien bestehen aus Produkten tierischen und pflanzlichen Ursprungs und haben eine unsichere chemische Zusammensetzung.

Es gibt Allzweck-Nährmedien (universell) und Spezial-Nährmedien. Allzweck-Nährmedien eignen sich zum Züchten vieler Arten von Mikroorganismen und als Grundlage für die Herstellung spezieller Nährmedien. Hierzu zählen beispielsweise Fleischextrakt-Brühe, Fleischextrakt-Agar, Hottinger-Brühe, Hottinger-Agar und andere. Spezielle Nährmedien dienen der selektiven Kultivierung bestimmter Arten von Mikroorganismen und der Untersuchung ihrer Eigenschaften und Lagerung.

Es gibt folgende Arten von Spezialmedien: elektiv (selektiv), differenzialdiagnostisch, konservativ. Die Selektivität des Nährmediums für bestimmte Mikrobenarten wird durch die Schaffung optimaler Bedingungen für diese (pH-Wert, Eh, Salzkonzentration, Nährstoffzusammensetzung) erreicht, d.h. positive Selektion oder durch Zugabe von Substanzen in die Umgebung, die andere Mikroben hemmen (Galle, Natriumazid, Kaliumtellurit, Antibiotika usw.), d. h. negative Auswahl. Die differenzierenden Eigenschaften des Nährmediums werden durch Zugabe eines Substrats erzeugt, zu dem das Verhältnis der Mikrobe (z. B. Zucker, Aminosäuren) und entsprechender Indikatoren (z. B. pH-Indikatoren - Bromthymolblau, Fuchsin; Eh-Indikatoren) bestimmt wird.

Je nach Konsistenz können Nährmedien flüssig, halbflüssig (0,2–0,7 % Agar) und dicht (1,5–2 % Agar) sein. Industriell hergestellte Trockennährmedien sind eine Form der Medienkonservierung.

Um Mikrovolumentechnologie zur biochemischen Identifizierung von Mikroorganismen bereitzustellen, werden kommerzielle Mikrotestsysteme hergestellt. Sie werden durch zwei Gruppen repräsentiert, die sich im Gehalt des Reaktionssubstrats unterscheiden: 1 - im Nährmedium; 2 - in der Trägervorlage. Testsysteme der ersten Gruppe enthalten mit Polyvinylalkohol stabilisierte dehydrierte Nährmedien in Mikrovolumenvertiefungen von Polystyrolplatten, zum Beispiel API-20E, Enterotest (Abb. 3.5), inländisches PBDE und MMTE 1 und E2.

Reis. 3.5.

Testsysteme der zweiten Gruppe verfügen über ein Substrat und einen Indikator in einer Papier- oder Polymerträgervorlage, zum Beispiel Micro-ID, Minitek. Es wurden auch Testsysteme auf Basis flüssiger Differenzmedien entwickelt, die direkt im Labor hergestellt werden können. Basierend auf den Ergebnissen biochemischer Tests wird die Art des Mikroorganismus mithilfe von Identifizierungstabellen, einem analytischen Codekatalog oder Geräten für automatisierte mikrobiologische Systeme zur biochemischen Identifizierung von Mikroorganismen ermittelt. Aufgrund der Beschleunigung der Forschung und der hohen Effizienz werden Mikrovolumen-Testsysteme in Laboratorien häufig eingesetzt.

Als natürliche Nährmedien werden tierische, pflanzliche und mikrobielle Produkte verwendet: Fleisch, Fischmehl, Milch, Eier, Blut, Kartoffeln, Hefe usw. Daraus werden Halbfabrikate hergestellt: Aufgüsse und Extrakte (Fleischwasser, Hefeextrakt) , enzymatische und saure Hydrolysate (Pepton, Hottinger-Verdau, Casein-Verdau usw.). Aufgüsse und Extrakte sind eine Quelle für Wachstumsfaktoren, Hydrolysate sind eine Quelle für Aminosäuren und andere organische Nährstoffe.

Als Versiegelungsmittel für Nährböden wird Agar-Agar oder Gelatine verwendet. Agar-Agar ist ein aus Algen gewonnenes Polysaccharid. Es ist in der Lage, in Wasser ein Gel zu bilden, das bei 80–86 °C schmilzt und bei 40–45 °C geliert; wird von den meisten Mikroorganismen nicht abgebaut. Gelatine ist ein aus Haut und Knochen gewonnenes Protein; Gelatinegel schmilzt bei 32–34 °C, geliert bei 26–28 °C (d. h. bei einer Inkubationstemperatur von 37 °C liegt es in flüssigem Zustand vor); von vielen Arten von Mikroorganismen abgebaut. Daher wird Gelatine selten verwendet.

Bei Bedarf wird der Nährboden durch Behandlung mit Hühnereiweiß, Molke oder Fällung geklärt. Gießen Sie das Medium in Kolben, Fläschchen und Reagenzgläser. Verwenden Sie saubere, unsterile Behälter, wenn das Medium bei 120 °C sterilisiert werden soll, oder sterile, wenn das Medium eine Sterilisation mit fließendem Dampf (100 °C) oder bei 112 °C erfordert. Verschließen Sie den Behälter mit dem Medium mit Baumwollgaze-Stopfen und Papierkappen. Abhängig von der Zusammensetzung des Mediums werden sie auf unterschiedliche Weise sterilisiert. Agarmedien, die keine Kohlenhydrate und natives Protein enthalten, sowie synthetische Medien werden in einem Autoklaven bei 115–120 °C für 15–20 Minuten sterilisiert. Medien, die Kohlenhydrate, Milch, Gelatine enthalten, werden mit fließendem Dampf bei 100 °C in Fraktionen oder im Autoklaven bei 112 °C für 15 Minuten sterilisiert. Medien, die natives Protein und Harnstoff enthalten, werden durch Filtration sterilisiert oder der sterilen Basis des Mediums werden sterile Komponenten (Blut, Serum usw.) zugesetzt. Fertige sterile Nährmedien werden einer Sterilitätskontrolle unterzogen, indem sie 1–3 Tage lang in einem Thermostat bei 37 °C aufbewahrt werden.

Im Feld ist es einfacher, Nährmedien aus trockenen Nährmedien (in Dosen) herzustellen. Eine Probe des auf dem Etikett angegebenen Trockenmediums wird destilliertem Wasser oder Leitungswasser zugesetzt und gekocht, bis sich das Pulver vollständig aufgelöst hat. Anschließend wird das Medium in sterile Kolben und Reagenzgläser gefüllt und sterilisiert. Einige Medien (z. B. Endo, Ploskireva, Levin) können ohne Sterilisation verwendet werden.

Alle Serien industriell hergestellter Nährmedien und alle im Labor hergestellten Chargen von Nährmedien unterliegen der bakteriologischen Kontrolle. Als Testkulturen werden typische oder lokale, in jeder Hinsicht typische Bakterienstämme in glatter Form verwendet. Folgende biologische Indikatoren des Nährmediums werden bestimmt: Empfindlichkeit (Wachstum), Hemmeigenschaften, Differenzierungseigenschaften, Wachstumsrate von Bakterien auf dem Medium, Reproduzierbarkeit.

Die Empfindlichkeit des Nährmediums wird durch die Mindestanzahl koloniebildender Einheiten (KBE) von Bakterien bestimmt, die das Auftreten von Koloniewachstum auf dem Medium gewährleisten, oder durch die maximale zehnfache Verdünnung der Kultur ab einer Anfangskonzentration von 10 Einheiten. Trübung (gemäß dem optischen Trübungsstandard), wodurch das Auftreten von Bakterienwachstum auf allen beimpften Petrischalen sichergestellt wird. Die hemmenden Eigenschaften des Mediums werden als Grad der Unterdrückung anderer Mikroflora durch die Inokulumdosis in KBE, vollständig auf dem Medium unterdrückt, oder als Verhältnis der Anzahl gewachsener Bakterienkolonien zur geschätzten Anzahl inokulierter Bakterien beurteilt. Die differenzierenden Eigenschaften von Medien werden untersucht, indem die Testbakterienspezies in einer Mischung mit assoziierten Bakterien beimpft werden und anschließend die Klarheit der Differenzierung der Kolonien der gewünschten Bakterien von den assoziierten Bakterien bestimmt wird. Die Spezifität der differenzierenden Eigenschaft des Mediums wird durch das Fehlen dieser Eigenschaft bei anderen Bakterienarten außer den erforderlichen deutlich. Die Wachstumsrate der Bakterien auf dem Medium wird durch die minimale Inkubationszeit der Kulturpflanzen (in Stunden) bestimmt, während der ein deutliches Wachstum der Kultur mit bloßem Auge (bei selektiven Medien) oder die Bildung von Kolonien mit typischen Differenzierungsmerkmalen sichtbar ist sichergestellt. Die Reproduzierbarkeit biologischer Parameter von Medien wird anhand der Häufigkeit identischer Ergebnisse (in %) beurteilt, wenn Medien mit denselben Bakterienstämmen wiederverwendet werden. Die Kontrolle verschiedener Nährmedien auf biologische Indikatoren erfolgt nach spezifischen Methoden und Standards, die sich an offiziellen Dokumenten orientieren.

Die physikalisch-chemische Kontrolle von Nährmedien in der Laborpraxis erfolgt hinsichtlich pH, ​​hH und Aminstickstoffgehalt. Bei der industriellen Herstellung von Nährmedien werden üblicherweise weitere Indikatoren untersucht. Zur Bestimmung des pH- und hH-Werts von Medien werden pH-Meter, Indikatorpapiere und verschiedene chemische pH- und hH-Indikatoren verwendet, die den Nährmedien zugesetzt werden. Der Gehalt an Aminstickstoff wird mit der Methode der pH-metrischen Formol-Titration von Nährmedien nach GOST untersucht.

Im dritten Schritt erfolgt die Untersuchung der biochemischen Eigenschaften der isolierten Mikroorganismen. Die Reinheit der auf dem Schrägagar gezüchteten Kultur der Mikroorganismen wird durch Mikroskopie von Gram-gefärbten Ausstrichen überprüft. Bei der Mikroskopie wird auf die Form der Mikrobe, die Größe und die Lage der Zelle geachtet. Zur Identifizierung von Sporen, Kapseln, Einschlüssen und Flagellen werden spezielle Färbungen verwendet.

Zur Pflanzenidentifikation, z.B. Zur Bestimmung der Art und Art der Bakterien werden neben morphologischen und kulturellen Merkmalen auch biochemische, antigene und andere Eigenschaften untersucht.

Unter mikrobiologischer Forschung versteht man die Isolierung reiner Kulturen von Mikroorganismen, deren Kultivierung und Untersuchung ihrer Eigenschaften. Kulturen, die aus Mikroorganismen derselben Art bestehen, werden als rein bezeichnet. Sie werden bei der Diagnose von Infektionskrankheiten, zur Bestimmung der Art und Art von Mikroben, bei Forschungsarbeiten, zur Gewinnung von Abfallprodukten von Mikroben (Toxine, Antibiotika, Impfstoffe etc.) benötigt.

Für die Kultivierung von Mikroorganismen (Kultivierung unter künstlichen Bedingungen in vitro) werden spezielle Substrate benötigt – Nährmedien. Auf Medien führen Mikroorganismen alle Lebensprozesse aus (essen, atmen, vermehren usw.), weshalb sie auch als Kulturmedien bezeichnet werden.

Kulturmedien

Nährmedien sind die Grundlage mikrobiologischer Arbeiten und ihre Qualität bestimmt oft die Ergebnisse der gesamten Studie. Umgebungen müssen optimale (beste) Bedingungen für das Leben von Mikroben schaffen.

Umgebungsanforderungen

Umgebungen müssen die folgenden Anforderungen erfüllen:

1) nahrhaft sein, d. h. in leicht verdaulicher Form alle Stoffe enthalten, die zur Deckung des Ernährungs- und Energiebedarfs notwendig sind. Sie sind Quellen für Organogene und mineralische (anorganische) Stoffe, darunter auch Spurenelemente. Mineralstoffe dringen nicht nur in die Zellstruktur ein und aktivieren Enzyme, sondern bestimmen auch die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Medien (osmotischer Druck, pH-Wert etc.). Bei der Kultivierung einer Reihe von Mikroorganismen werden den Medien Wachstumsfaktoren zugesetzt – Vitamine, einige Aminosäuren, die die Zelle nicht synthetisieren kann;

Aufmerksamkeit! Mikroorganismen benötigen wie alle Lebewesen viel Wasser.

2) haben eine optimale Konzentration an Wasserstoffionen - pH-Wert, da Mikroorganismen nur bei einer optimalen Reaktion der Umgebung, die sich auf die Durchlässigkeit der Schale auswirkt, Nährstoffe aufnehmen können.

Für die meisten pathogenen Bakterien ist ein leicht alkalisches Milieu (pH 7,2-7,4) optimal. Ausnahmen bilden Vibrio cholerae – sein Optimum liegt im alkalischen Bereich (pH 8,5–9,0) und der Erreger der Tuberkulose, der eine leicht saure Reaktion erfordert (pH 6,2–6,8).

Um zu verhindern, dass die sauren oder alkalischen Produkte ihrer lebenswichtigen Aktivität den pH-Wert während des Wachstums von Mikroorganismen verändern, müssen die Medien gepuffert sein, d. h. Substanzen enthalten, die die Produkte neutralisieren; Austausch;

3) für die Mikrobenzelle isotonisch sein; das heißt, der osmotische Druck in der Umgebung muss derselbe sein wie im Inneren der Zelle. Für die meisten Mikroorganismen ist eine 0,5 %ige Natriumchloridlösung die optimale Umgebung;

4) steril sein, da fremde Mikroben das Wachstum der untersuchten Mikrobe, die Bestimmung ihrer Eigenschaften und die Veränderung der Eigenschaften des Mediums (Zusammensetzung, pH-Wert usw.) beeinträchtigen;

5) feste Medien müssen feucht sein und eine optimale Konsistenz für Mikroorganismen haben;

6) haben ein bestimmtes Redoxpotential, d. h. das Verhältnis von elektronenabgebenden und elektronenaufnehmenden Stoffen, ausgedrückt durch den RH 2-Index. Dieses Potenzial zeigt die Sättigung der Umgebung mit Sauerstoff. Manche Mikroorganismen benötigen ein hohes Potenzial, andere ein niedriges. Beispielsweise vermehren sich Anaerobier bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von nicht mehr als 5 und Aerobier bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von nicht weniger als 10. Das Redoxpotential der meisten Umgebungen erfüllt die Anforderungen von Aerobiern und fakultativen Anaerobiern;

7) möglichst einheitlich sein, also konstante Mengen einzelner Zutaten enthalten. Daher sollten Medien für die Kultivierung der meisten pathogenen Bakterien 0,8–1,2 g/l Aminstickstoff NH 2 enthalten, d. h. den Gesamtstickstoff der Aminogruppen von Aminosäuren und niederen Polypeptiden; 2,5–3,0 g/l Gesamtstickstoff N; 0,5 % Chloride bezogen auf Natriumchlorid; 1 % Pepton.

Es ist wünschenswert, dass die Medien transparent sind – so lässt sich das Pflanzenwachstum bequemer überwachen und eine Kontamination der Umgebung mit fremden Mikroorganismen leichter erkennen.

Klassifizierung von Medien

Der Bedarf an Nährstoffen und Umwelteigenschaften variiert je nach Art von Mikroorganismen. Dadurch entfällt die Möglichkeit, eine universelle Umgebung zu schaffen. Darüber hinaus wird die Wahl einer bestimmten Umgebung von den Zielen der Studie beeinflusst.

Derzeit wurde eine Vielzahl von Umgebungen* vorgeschlagen, deren Klassifizierung auf den folgenden Merkmalen basiert.

1. Quellkomponenten. Anhand der Ausgangskomponenten werden natürliche und synthetische Medien unterschieden. Natürliche Medien werden aus Produkten tierischen und pflanzlichen Ursprungs hergestellt. Bis zur Gegenwart; Im Laufe der Zeit wurden Medien entwickelt, in denen wertvolle Lebensmittelprodukte (Fleisch usw.) durch Non-Food-Produkte ersetzt werden: Knochen- und Fischmehl, Futterhefe, Blutgerinnsel usw. Trotz der Tatsache, dass die Zusammensetzung der Nährmedien aus Naturprodukte sind sehr komplex und variieren je nach Ausgangsstoff. Diese Medien werden häufig verwendet. Synthetische Medien werden aus bestimmten chemisch reinen organischen und anorganischen Verbindungen hergestellt, in genau festgelegten Konzentrationen aufgenommen und in bidestilliertem Wasser gelöst. Ein wichtiger Vorteil dieser Medien besteht darin, dass ihre Zusammensetzung konstant ist (es ist bekannt, wie viel und welche Stoffe sie enthalten) und diese Medien daher leicht reproduzierbar sind.

2. Konsistenz(Grad der Dichte). Medien sind flüssig, dicht und halbflüssig. Feste und halbflüssige Medien werden aus flüssigen Medien hergestellt, denen normalerweise Agar-Agar oder Gelatine zugesetzt wird, um ein Medium mit der gewünschten Konsistenz zu erhalten.

Agar-Agar ist ein Polysaccharid, das aus bestimmten Algenarten gewonnen wird. Es ist kein Nährstoff für Mikroorganismen und dient lediglich der Verdichtung der Umwelt. In Wasser schmilzt Agar bei 80–100 °C und erstarrt bei 40–45 °C.

Gelatine ist ein tierisches Protein. Gelatinemedien schmelzen bei 25–30 °C, daher werden Pflanzen normalerweise bei Raumtemperatur darauf angebaut. Die Dichte dieser Medien nimmt bei einem pH-Wert unter 6,0 und über 7,0 ab und sie härten schlecht aus. Einige Mikroorganismen nutzen Gelatine als Nährstoff – während sie wachsen, verflüssigt sich das Medium.

Als feste Medien werden außerdem geronnenes Blutserum, geronnene Eier, Kartoffeln und Medien mit Kieselgel verwendet.

3. Verbindung. Umgebungen werden in einfache und komplexe Umgebungen unterteilt. Zu den ersten gehören Fleischpeptonbrühe (MPB), Fleischpeptonagar (MPA), Hottinger-Brühe und -Agar, nahrhafte Gelatine und Peptonwasser. Komplexe Medien werden durch Zugabe von Blut, Serum, Kohlenhydraten und anderen Substanzen, die für die Reproduktion eines bestimmten Mikroorganismus notwendig sind, zu einfachen Medien hergestellt.

4. Zweck: a) Basismedien (üblicherweise verwendet) werden für die Kultivierung der meisten pathogenen Mikroben verwendet. Dies sind die oben genannten MPA, MPB, Hottinger-Brühe und Agar, Peptonwasser;

b) Zur Isolierung und Züchtung von Mikroorganismen, die auf einfachen Medien nicht wachsen, werden spezielle Medien verwendet. Beispielsweise wird für die Kultivierung von Streptokokken den Medien Zucker zugesetzt, für Pneumo- und Meningokokken – Blutserum, für den Erreger von Keuchhusten – Blut;

c) elektive (selektive) Umgebungen dienen der Isolierung einer bestimmten Art von Mikroben, deren Wachstum sie begünstigen, indem sie das Wachstum begleitender Mikroorganismen verzögern oder unterdrücken. So machen Gallensalze, die das Wachstum von E. coli unterdrücken, die Umwelt für den Erreger von Typhus wählerisch. Medien werden selektiv, wenn ihnen bestimmte Antibiotika oder Salze zugesetzt werden und sich der pH-Wert ändert.

Flüssige Wahlmedien werden als Akkumulationsmedien bezeichnet. Ein Beispiel für ein solches Medium ist Peptonwasser mit einem pH-Wert von 8,0. Bei diesem pH-Wert vermehrt sich Vibrio cholerae aktiv und andere Mikroorganismen wachsen nicht;

d) Differenzialdiagnostische Medien ermöglichen die Unterscheidung (Differenzierung) einer Mikrobenart von einer anderen durch enzymatische Aktivität, beispielsweise Hiss-Medien mit Kohlenhydraten und einem Indikator. Mit dem Wachstum von Mikroorganismen, die Kohlenhydrate abbauen, ändert sich die Farbe des Mediums;

e) Konservierungsmedien sind für die Erstaussaat und den Transport des Testmaterials bestimmt; Sie verhindern das Absterben pathogener Mikroorganismen und unterdrücken die Entwicklung von Saprophyten. Ein Beispiel für ein solches Medium ist eine Glycerinmischung, die in Studien zum Nachweis einer Reihe von Darmbakterien zum Sammeln von Stuhl verwendet wird.

Rezepte zur Vorbereitung einiger Medien finden Sie am Ende des nächsten Abschnitts und im zweiten Teil des Lehrbuchs.

Kontrollfragen

1. Welche Anforderungen müssen Nährmedien erfüllen?

2. Wie werden Medien nach ihren Ausgangsbestandteilen klassifiziert?

3. Welche Stoffe dienen der Verdichtung von Medien?

4. Welche Medien sind einfach oder häufig verwendet und wofür werden sie verwendet?

5. Welche Umgebungen werden als komplex bezeichnet, was dient ihnen als Grundlage?

6. Welche Umgebungen ermöglichen das bevorzugte Wachstum einiger Mikroben, während andere unterdrückt werden?

7. Auf welchen Medien wird die enzymatische Aktivität von Mikroben untersucht?

Übung

Füllen Sie das Formular aus und geben Sie an, in welche Gruppen die Umgebungen unterteilt sind.

Vorbereitung der Medien

Geschirr zur Zubereitung von Medien sollte keine Fremdstoffe enthalten, wie z. B. von einigen Glasarten freigesetzte Laugen oder Eisenoxide, die beim Kochen in rostigen Pfannen in das Medium gelangen können. Am besten verwenden Sie Kochgeschirr aus Glas, Emaille oder Aluminium. Große Mengen des Mediums (zige und hunderte Liter) werden in speziellen Fermentern oder Reaktoren aufbereitet (Abb. 14). Vor dem Gebrauch muss das Geschirr gründlich gewaschen, gespült und getrocknet werden. Neue Glaswaren werden 30 Minuten lang in einer 1-2%igen Salzsäurelösung vorgekocht oder über Nacht in diese Lösung getaucht und anschließend eine Stunde lang unter fließendem Wasser gespült.

Aufmerksamkeit! Schalen, die für die Zubereitung von Medien bestimmt sind, dürfen nicht für andere Zwecke verwendet werden, beispielsweise zur Aufbewahrung chemischer Reagenzien oder Desinfektionslösungen – bereits Spuren dieser Stoffe können das Wachstum von Mikroorganismen beeinträchtigen.

Rohstoff Für die Herstellung der meisten Medien werden Produkte tierischen oder pflanzlichen Ursprungs verwendet: Fleisch und seine Ersatzstoffe, Milch, Eier, Kartoffeln, Sojabohnen, Mais, Hefe usw.

Basische Nährbrühen werden aus Fleischwasser oder verschiedenen Aufschlüssen hergestellt, die durch saure oder enzymatische Hydrolyse des Ausgangsmaterials gewonnen werden. Aus Aufschlüssen hergestellte Brühen sind 5–10 Mal wirtschaftlicher als Brühen aus Fleischwasser. Verdaute Medien sind reicher an Aminosäuren und daher nahrhafter; Sie haben eine größere Pufferkapazität, d. h. sie haben einen stabileren pH-Wert. Darüber hinaus können Verdauungsprodukte aus Fleischersatzstoffen (Blutgerinnsel, Plazenta, Kasein usw.) hergestellt werden.

Derzeit ist die Versorgung der Labore mit Fleischwasser und Verdauungsprodukten zentralisiert. Am häufigsten verwenden sie Pankreasverdau von Hottinger, Kaseinhydrolysate oder Futterhefe. Aus diesen Halbzeugen werden nach bestimmten Rezepturen die notwendigen Medien hergestellt.

Kochschritte mittel: 1) Kochen; 2) Ermittlung des optimalen pH-Wertes; 3) Aufhellung; 4) Filtrierung; 5) verschütten; 6) Sterilisation; 7) Kontrolle.

Gekocht Umgebung über einem offenen Feuer, einem Wasserbad, einem Autoklaven oder dampfbeheizten Kochern.

pH-Wert einstellen Medien werden etwa aus Indikatorpapieren hergestellt. Um den pH-Wert genau zu bestimmen, verwenden Sie ein Potentiometer mit Glaselektroden gemäß den Anweisungen oder einen Komparator (Michaelis-Gerät), bestehend aus einem Ständer mit Nestern für Reagenzgläser (Abb. 15) und einer Reihe von Standards für einen bestimmten pH-Wert. Bei der Vorbereitung von Medien verwenden sie normalerweise den Indikator Metanitrophenol, der seine Farbe im Bereich von 6,8 bis 8,4 ändert.

Zur Bestimmung des pH-Wertes des Mediums werden in die Steckplätze 1, 2, 3 und 5 4 Reagenzgläser eingesetzt, deren Durchmesser und Glasfarbe sich nicht von den Reagenzgläsern mit Standards unterscheiden (siehe Abb. 15). In das 1. und 3. Reagenzglas werden 5 ml destilliertes Wasser gegossen; im 5. - 7 ml; im 2. - 4 ml Wasser und 1 ml Indikator. Standards für den erforderlichen pH-Wert werden in den Steckplätzen 4 und 6 platziert. 2 ml abgekühltes Medium werden in das 1., 2. und 3. Reagenzglas gegossen. Der Inhalt der Reagenzgläser wird gemischt.

Die Farbe von Flüssigkeiten in Reagenzgläsern wird im Durchlicht verglichen, indem der hintere Schlitz des Geräts mit einem Filter abgedeckt wird (matt oder blau, wenn die Flüssigkeiten intensiv gelb sind). Der pH-Wert der Testlösung entspricht dem pH-Wert des Standards, dessen Farbe mit seiner Farbe übereinstimmt.

Bei der Herstellung von Medien mit einem bestimmten pH-Wert werden Standards in die Schlitze 4 und 6 gegeben, deren pH-Wert nahe am erforderlichen liegt, und eine bestimmte Menge Alkalilösung wird aus einer Bürette in das 2. Reagenzglas mit dem Testmedium und gegeben Indikator, wenn die Flüssigkeit im 2. Reagenzglas leichter als die Standards ist, oder Säurelösung – wenn die Standards leichter sind. Das Alkali (oder die Säure) wird hinzugefügt, bis die Farbe der Flüssigkeit im 2. Reagenzglas mit der Farbe der Standards übereinstimmt. Die Menge an Alkali (oder Säure), die zu 2 ml Medium im 2. Reagenzglas hinzugefügt wird, wird für das gesamte Volumen des vorbereiteten Mediums neu berechnet. Um beispielsweise den gewünschten pH-Wert zu erreichen, wurden 2 Tropfen (0,1 ml) 0,05 N zu 2 ml Medium gegeben. Alkalilösung, dann braucht man zum Alkalisieren von 1 Liter das 500-fache, also 50 ml 0,05 N. oder 2,5 ml 1 N. Alkalilösung.

Während der Sterilisation sinkt der pH-Wert des Mediums um 0,2. Um ein Medium mit einem pH-Wert von 7,2–7,4 zu erhalten, wird es daher zunächst mit einem pH-Wert von 7,4–7,6 hergestellt.

Aufhellung Medien entstehen, wenn diese beim Kochen trüb oder dunkel werden. Zum Klären das mit der doppelten Menge Wasser geschlagene Eiweiß eines Hühnereis in ein auf 50° C erhitztes Medium geben, verrühren und aufkochen. Während das Protein koaguliert, transportiert es im Medium suspendierte Partikel in das Sediment. Ebenso können Sie anstelle von Eiweiß Blutserum verwenden (20-30 ml pro 1 Liter Medium).

Filtration Flüssige und geschmolzene Gelatinemedien werden durch nasse Papier- oder Stofffilter hergestellt. Die Filtration von Agarmedien ist schwierig – sie härten schnell aus. Normalerweise werden sie durch einen Baumwollgazefilter gefiltert (eine Mullserviette wird in einen Trichter gelegt und ein üppiger Wattebausch darauf gelegt). Wenn Sie in einem heißen Autoklaven oder beheizten Trichtern filtern, können Sie Papier- oder Stofffilter verwenden.

Die Filtration von Agarmedien kann durch Absetzen ersetzt werden. Das Medium wird in ein hohes zylindrisches Gefäß gegossen und in einem Autoklaven geschmolzen. Wenn das Medium im ausgeschalteten Gerät langsam abkühlt, setzen sich die darin schwebenden Partikel am Boden ab. Am nächsten Tag wird das Agargerinnsel aus dem Gefäß entfernt (dazu wird das Gefäß kurz in heißes Wasser gestellt) und der untere Teil mit dem angesammelten Bodensatz mit einem Messer abgeschnitten. Der obere Teil wird geschmolzen und in entsprechende Behälter gegossen.

Verschüttet Medien in Reagenzgläser (jeweils 3-5 ml oder 10 ml), Fläschchen, Kolben, Matratzen und Flaschen mit nicht mehr als 2/3 des Fassungsvermögens füllen, da während der Sterilisation die Stopfen nass werden können und die Medien ihre Sterilität verlieren.

Medien, die bei Temperaturen über 100 °C sterilisiert werden, werden in saubere, trockene Behälter gefüllt. Medien, die bei niedrigeren Temperaturen sterilisiert werden, müssen in sterile Behälter gefüllt werden.

Das Einfüllen der Medien erfolgt über einen Trichter, an dessen Ende sich ein Gummischlauch mit Mohr-Klemme befindet. Zur dosierten Abgabe werden Bechergläser, Büretten, Dispenser, Spritzen, Pipetten usw. verwendet (Abb. 16).

Die Behälter mit dem Medium werden üblicherweise mit Baumwollgaze-Stopfen verschlossen, über die Papierkappen gestülpt werden. Es ist wichtig, dass das Medium beim Verschütten die Ränder des Geschirrs nicht benetzt, da sonst Stopfen daran kleben bleiben können. An jedem Gefäß muss ein Etikett mit der Bezeichnung des Mediums und dem Herstellungsdatum angebracht sein.

Sterilisation. Der Sterilisationsmodus hängt von der Zusammensetzung des Mediums ab und ist in dessen Rezept angegeben. Ein ungefähres Diagramm des Mediensterilisationsregimes ist in der Tabelle angegeben. 8.

1 (Flüssige Medien, die Kohlenhydrate, Proteine ​​oder Vitamine enthalten, werden am besten mit Bakterienfiltern sterilisiert.)

Kontrolle Vorbereitete Medien: a) Um die Sterilität der Medien zu kontrollieren, legen Sie sie 2 Tage lang in einen Thermostat und untersuchen Sie sie anschließend. Wenn auf den Medien keine Anzeichen von Wachstum zu erkennen sind, gelten sie als steril und mehrere Proben jeder Serie werden einer chemischen Kontrolle unterzogen; b) chemische Kontrolle: Der pH-Wert, der Gehalt an Gesamt- und Aminstickstoff, Pepton, Chloriden werden endgültig festgelegt (ihre Menge muss der im Rezept angegebenen Menge entsprechen).

Die chemische Kontrolle von Medien wird in einem chemischen Labor durchgeführt; c) Zur biologischen Kontrolle werden mehrere Proben des Mediums mit speziell ausgewählten Kulturen von Mikroorganismen beimpft und anhand ihres Wachstums die ernährungsphysiologischen (Wachstums-)Eigenschaften des Mediums beurteilt. Dem fertigen Medium liegen ein Etikett und ein Pass bei, auf denen Name und Zusammensetzung des Mediums, Kontrollergebnisse usw. angegeben sind.

Bewahren Sie die Medien bei Raumtemperatur in Schränken auf, die vorzugsweise speziell dafür ausgelegt sind. Einige Medien wie Blut- und Vitaminmedien werden im Kühlschrank aufbewahrt.

Rezepte zur Herstellung einfacher (Basis-)Medien und isotonischer Natriumchloridlösung

Isotonische Natriumchloridlösung. 9 g Natriumchlorid zu 1 Liter destilliertem Wasser hinzufügen. Die Lösung wird filtriert, der gewünschte pH-Wert eingestellt und ggf. 30 Minuten bei 120° C sterilisiert.

Fleischpeptonbrühe (MPB). Dem Fleischwasser werden 1 % Pepton und 0,5 % X zugesetzt. Teile Natriumchlorid, 10-15 Minuten bei schwacher Hitze kochen, um die Stoffe aufzulösen, den gewünschten pH-Wert einstellen und erneut 30-40 Minuten kochen, bis sich ein Niederschlag bildet. Filtern, Wasser auf das ursprüngliche Volumen hinzufügen und 20 Minuten bei 120 °C sterilisieren.

Hottinters Brühe. Der Hottinger-Aufschluss wird 5- bis 6-fach mit Wasser verdünnt, je nachdem, wie viel Aminstickstoff er enthält und wie viel davon in der Brühe enthalten sein soll (im Verdauungspass und in der Rezeptur des Mediums angegeben). Um beispielsweise ein Medium mit 1,2 g/l Aminstickstoff herzustellen, wird ein Aufschluss mit 9,0 g/l benötigt. g/l, muss 7-5-fach verdünnt werden (9,0:1,2). Fügen Sie 0,5 % Natriumchlorid zum verdünnten Aufschluss hinzu und kochen Sie es bei schwacher Hitze, bis sich das Salz auflöst. Stellen Sie im abgekühlten Medium den pH-Wert ein, filtrieren Sie, gießen Sie es ein und sterilisieren Sie es 20 Minuten lang bei

Fleischpepton-Agar (MPA). 2-3 % zerkleinertes Agar-Agar zur fertigen Brühe geben (vor oder nach der Sterilisation) und unter Rühren bei schwacher Hitze kochen, bis das Agar vollständig geschmolzen ist. MPA kann in einem Autoklaven oder Koch-Apparat gekocht werden. Das vorbereitete Medium wird bei Bedarf geklärt, filtriert und 20 Minuten lang bei 120 °C sterilisiert.

Halbfester Agar enthält 0,4–0,5 % Agar-Agar.

Nährstoffreiche Gelatine. Der fertigen Brühe werden 10-15 % Gelatine zugesetzt, bis sie schmilzt (nicht kochen!), in sterile Behälter gefüllt und mit fließendem Dampf sterilisiert.

Rezepte zur Vorbereitung komplexer Medien

Medien mit Kohlenhydraten. Die erforderliche Menge (0,1–2 %) eines bestimmten Kohlenhydrats (z. B. Glukose) wird der Hauptbrühe oder dem geschmolzenen Agar zugesetzt. Nach dem Auflösen in sterile Behälter füllen und mit fließendem Dampf sterilisieren. Da auch bei diesem Sterilisationsregime Kohlenhydrate teilweise zerstört werden, ist es vorzuziehen, sterilen Grundmedien eine 25-30%ige Kohlenhydratlösung, sterilisiert durch einen Bakterienfilter, in der erforderlichen Menge unter Keimfreiheit zuzusetzen – nach Überprüfung der Sterilität ist das Medium bereit zum Benutzen.

Medien mit Blut Hergestellt aus sterilen einfachen Medien unter Zugabe von 1 bis 30 % (normalerweise 5 %) sterilem defibriniertem Blut unter aseptischen Bedingungen (vorzugsweise in einer Box). Zuvor wird das Agarmedium geschmolzen und auf 45 °C abgekühlt. Die Temperatur des Mediums wird bestimmt, indem das Gefäß im Winkel des Unterkiefers an den Hals gehalten wird. Bei der richtigen Temperatur sollte ein erträgliches Hitzegefühl, aber kein Brennen, auftreten. Nach der Zugabe von Blut wird der Inhalt des Gefäßes bis zum Erstarren des Mediums gründlich gemischt und in Becher oder Reagenzgläser gegossen.

Aufmerksamkeit! Medien mit Blut können nicht geschmolzen werden – das Blut verändert seine Eigenschaften.

Medien mit Blutserum werden auf die gleiche Weise wie Blutmedien hergestellt. Zu den Grundmedien werden 10–20 % Serum hinzugefügt, das kein Konservierungsmittel enthält und zuvor 30 Minuten lang bei 56 °C im Wasserbad oder in einem Inaktivator inaktiviert wurde. Bei der Inaktivierung wird ein Stoff (Komplement) zerstört, der eine schädliche Wirkung auf Mikroben hat.

Medien mit Galle. Einfachem Medium wird Galle in einer Menge von 10–40 % des Mediumvolumens zugesetzt, der gewünschte pH-Wert eingestellt und 20 Minuten bei 120 °C sterilisiert. Sterile Galle kann unter aseptischen Bedingungen einem sterilen Medium zugesetzt werden.

Agarmedien in Petrischalen gießen. Vor dem Ausgießen werden die Medien in einem Wasserbad geschmolzen und auf 45–50 °C abgekühlt. Typischerweise reichen für einen Becher mit einem Durchmesser von 9 cm 15–20 ml Medien aus (Schichthöhe 0,25–0,3 cm). Ist die Schicht höher, sehen die Kolonien darauf weniger kontrastreich aus. Bei einer sehr dünnen Schicht wird die Menge an Nährstoffen und Feuchtigkeit stark eingeschränkt (das Medium trocknet schnell aus) – die Anbaubedingungen verschlechtern sich.

Gießen Sie die Medien unter aseptischen Bedingungen in sterile Becher. Die Tassen werden mit dem Deckel nach oben gestellt. Das Gefäß mit dem Medium wird in die rechte Hand genommen und in die Nähe des Feuers gehalten. Entfernen Sie den Korken mit der linken Hand und halten Sie ihn mit Ihrem kleinen Finger und Ihrer Handfläche fest. Der Hals des Gefäßes ist verbrannt und der Deckel wird mit zwei Fingern der linken Hand leicht geöffnet. Legen Sie den Flaschenhals darunter, ohne den Rand des Bechers zu berühren. Achten Sie beim Eingießen des Mediums darauf, dass es gleichmäßig über den Boden des Bechers verteilt wird. Wenn sich während eines Verschüttens Luftblasen auf der Oberfläche des Mediums bilden, richten Sie ein Streichholz oder eine Brennerflamme darauf aus, bevor das Medium aushärtet – die Blasen werden platzen. Anschließend wird der Becher verschlossen und das Medium erstarren gelassen. Erfolgt die Aussaat am Tag der Verschüttung, muss das Substrat getrocknet werden. Öffnen Sie dazu vorsichtig die Tassen im Thermostat und stellen Sie die Deckel und Tassen mit der offenen Seite nach unten für 20-30 Minuten auf. Erfolgt die Aussaat am Tag nach der Verschüttung, werden die Becher ohne Trocknung in das gleiche Papier eingewickelt, in dem sie sterilisiert wurden, und in den Kühlschrank gestellt.

Vorbereitung von Schrägagar. Reagenzgläser mit 4-5 ml sterilem geschmolzenem Agarmedium werden schräg gestellt (ungefähr in einem Winkel von 20°), sodass das Medium nicht über 2/3 des Reagenzglases hinausragt, da es sonst zu Benetzung des Stopfens kommen kann. Nach dem Erstarren des Mediums werden die Reagenzgläser senkrecht gestellt und das Kondensat ablaufen gelassen. Es ist besser, frisch geschnittenen Agar zu verwenden.

Aufmerksamkeit! Sie können keine Umgebung verwenden, in der es keine Kondensation gibt. Es sollte erneut im Wasserbad geschmolzen und gemäht werden.

Trockene Umgebungen

Die heimische Industrie stellt Trockenmedien für verschiedene Zwecke her: einfache, elektive, differenzialdiagnostische, spezielle. Dabei handelt es sich um Pulver in Flaschen mit Schraubverschluss. Bewahren Sie trockene Medien an einem dunklen Ort und gut verschlossen auf – sie sind hygroskopisch. Im Labor werden Medien gemäß den Anweisungen auf dem Etikett aus Pulvern hergestellt.

Die Vorteile trockener Medien im Vergleich zu im Labor hergestellten Medien sind ihre Standardbeschaffenheit (sie werden in großen Mengen hergestellt), die einfache Zubereitung, wodurch sie unter allen (auch Reise-) Bedingungen verfügbar sind, Stabilität und Kosteneffizienz. Wichtig ist, dass sie aus Fleischersatzstoffen hergestellt werden können: hydrolysiertes Kasein, Fibrin, Sprotte und sogar Proteinfraktionen mikrobieller Zellen (Sarcin).

Kontrollfragen

1. Wie hoch sollte der pH-Wert von Medien zur Kultivierung der meisten pathogenen Mikroben vor der Sterilisation sein und warum?

2. Bei welcher Temperatur schmelzen und erstarren Agarmedien?

3. Wie sollen die Gerichte zubereitet werden, in die Medien mit Kohlenhydraten und Proteinen eingefüllt werden?

Übung

1. MPB, MPA, Brühe und Hottinger-Agar mit pH 7,2–7,4 vorbereiten, in Fläschchen und Reagenzgläser füllen; sterilisieren.

2. Bereiten Sie Hiss-Medium aus trockenen Pulvern vor, gießen Sie 4–5 ml in Reagenzgläser und sterilisieren Sie es.

3. Bereiten Sie Blutagar vor und gießen Sie ihn in Petrischalen.

4. Bereiten Sie Endo-, EMS- und Ploskirev-Medien aus trockenen Pulvern vor und gießen Sie sie in Petrischalen.

5. Bereiten Sie Agar-Schrägagar vor.

Aussaatmethoden

Eine wichtige Phase der bakteriologischen Forschung ist die Kultur. Abhängig vom Zweck der Studie, der Art des Inokulums und der Umgebung werden unterschiedliche Impfmethoden verwendet. Sie alle beinhalten das obligatorische Ziel: die Ernte vor fremden Mikroben zu schützen. Deshalb sollten Sie zügig arbeiten, aber ohne plötzliche Bewegungen, die die Luftvibrationen verstärken. Während der Aussaat kann man nicht sprechen. Es ist besser, die Aussaat in einer Kiste vorzunehmen.

Aufmerksamkeit! Denken Sie daran, bei der Arbeit mit infektiösem Material die persönlichen Sicherheitsvorkehrungen zu beachten.

Kultur von Reagenzglas zu Reagenzglas. Das Reagenzglas mit dem Inokulum und das Reagenzglas mit dem Medium werden in der linken Hand leicht geneigt zwischen Daumen und Zeigefinger gehalten, sodass die Ränder der Reagenzgläser auf gleicher Höhe sind und ihre Böden auf der Hand liegen. Normalerweise wird das Reagenzglas mit dem Inokulum näher bei Ihnen aufbewahrt. Eine Bakterienschlaufe wird wie ein Stift in der rechten Hand gehalten und sterilisiert, indem man sie senkrecht in die Flamme eines Brenners hält. Entfernen Sie mit dem kleinen Finger und der Kante der rechten Handfläche beide Stecker gleichzeitig. Das Entfernen der Stopfen erfolgt nicht ruckartig, sondern sanft – mit leichten Schraubbewegungen. Nach dem Entfernen der Stopfen werden die Ränder der Reagenzgläser in der Flamme des Brenners verbrannt. Die kalzinierte Öse wird durch die Brennerflamme in ein Reagenzglas mit Inokulum eingeführt, abgekühlt und, nachdem etwas Material gesammelt wurde, vorsichtig in ein Reagenzglas mit dem Medium überführt.

Bei der Aussaat in einem flüssigen Medium wird das Saatgut an der Wand des Reagenzglases über der Flüssigkeit zerrieben und mit dem Medium abgewaschen.

Beim Beimpfen auf flüssige Medien mit einem Tupfer wird dieser in das Medium eingetaucht und darin 3-5 Sekunden lang gespült. Bei der Beimpfung auf ein festes Medium wird das Material in die Oberfläche gerieben, wobei der Tupfer rotiert wird. Anschließend wird der Tupfer desinfiziert (in das Reagenzglas gegeben, in dem er an das Labor geliefert und autoklaviert wurde).

Aufmerksamkeit! Achten Sie darauf, dass das Medium nicht ausläuft und den Stopfen nicht benetzt.

Bei der Beimpfung auf Agar-Schrägagar wird das Material üblicherweise in einer Zick-Zack-Bewegung von unten nach oben auf der Oberfläche des Mediums gemahlen, beginnend an der Kondensatgrenze.

Bei der Aussaat auf festen Medien, die in Reagenzgläsern in einer Säule gegossen werden, wird die Säule mit einer Öse mit Saatmaterial durchstochen, wodurch die sogenannte „Prick“-Aussaat erfolgt.

Nach der Aussaat wird die Schlaufe aus dem Reagenzglas entfernt, die Ränder der Reagenzgläser werden verbrannt und nach dem Durchführen der Stopfen durch die Flamme des Brenners werden die Reagenzgläser verschlossen und anschließend die Schlaufe kalziniert.

Die Beimpfung von flüssigem Material kann mit sterilen Pipetten (Pasteur- oder Messpipetten) erfolgen. Nach der Beimpfung werden die Pipetten in eine desinfizierende Flüssigkeit getaucht.

Die Inokulation in Fläschchen, Matratzen und Flaschen erfolgt ungefähr auf die gleiche Weise wie in Reagenzgläsern, nur wird zunächst das Material gesammelt (mit einer Öse oder in einer Pipette) und dann das Gefäß mit dem Medium geöffnet.

Die Gefäße mit der angeimpften Kultur werden beschriftet und in einen Thermostat gestellt.

Inokulation in Reagenzgläser aus einer Petrischale. Nachdem Sie das Wachstumsmuster der Kultur auf dem Becher untersucht haben, markieren Sie mit einem Wachsstift die für die Aussaat benötigte Fläche von unten. Der Becher mit dem Samen wird mit geöffnetem Deckel vor Ihnen platziert. Öffnen Sie mit der linken Hand den Deckel leicht und führen Sie die verbrannte Schlaufe darunter ein. Sammeln Sie nach dem Abkühlen der Schleife das Saatgut aus dem markierten Bereich. Nehmen Sie die Öse heraus, schließen Sie den Becher und nehmen Sie das Reagenzglas mit dem Medium in die linke Hand. Die Beimpfung erfolgt wie von Reagenzglas zu Reagenzglas. Nach der Aussaat wird der Becher auf den Kopf gestellt.

Aussaat auf Agar in Petrischalen. Aussaat mit Spachtel. Ein Spatel ist ein Glas- oder Metallrohr, dessen Ende in Form eines Dreiecks gebogen ist. Aus einer Pasteurpipette kann ein Spatel hergestellt werden, indem das dünne Ende schräg gebogen und in einer Brennerflamme vorgeheizt wird.

Öffnen Sie mit der linken Hand den Deckel leicht und halten Sie ihn mit Daumen und Zeigefinger fest. Tragen Sie das Inokulum mit einer Öse, einer Pipette oder einem Glasstab auf die Oberfläche des Mediums auf und reiben Sie es dann vorsichtig mit einer kreisenden Bewegung des Spatels ein, bis der Spatel nicht mehr frei über die Oberfläche des Mediums gleitet. Halten Sie dabei den Deckel fest mit der linken Hand und gleichzeitiges Drehen der Tasse. Nehmen Sie am Ende der Aussaat den Spatel aus dem Becher und schließen Sie den Deckel. Ein Glasspatel wird in eine Desinfektionslösung gelegt und ein Metallspatel in einer Brennerflamme kalziniert.

Aussaat mit einer Schleife. Eine kleine Menge Inokulum (manchmal in einer sterilen isotonischen Lösung oder Brühe voremulgiert) wird mit einer Schlinge in die Oberfläche des Mediums am Rand der Schale eingerieben, wobei die Schlinge mehrmals von einer Seite zur anderen geführt wird. Dann wird der Agar an der Stelle, an der die Streifen enden, mit einer Öse durchstochen, um überschüssiges Samenmaterial zu entfernen. Das auf der Schlaufe verbleibende Saatgut wird in einer Zick-Zack-Bewegung über die gesamte Oberfläche des Mediums verteilt. Schließen Sie am Ende der Aussaat den Becher und brennen Sie die Schlaufe durch.

Aussaat mit einer Schleife in Sektoren. Der Becher ist von unten in Sektoren unterteilt. Die Aussaat erfolgt im Zickzack vom Rand des Bechers zur Mitte hin. Es ist darauf zu achten, dass die Striche nicht in den angrenzenden Sektor hineinragen.

Aussaat mit Tupfer. Ein Tampon mit Inokulum wird in einen leicht geöffneten Becher gegeben und sein Inhalt wird in kreisenden Bewegungen in die Oberfläche des Mediums eingerieben, während Tampon und Becher rotieren.

Den Rasen säen. Ungefähr 1 ml (20 Tropfen) Flüssigkultur (wenn die Kultur aus einem festen Medium stammt, wird sie in einer sterilen isotonischen Lösung oder Brühe emulgiert) wird auf die Oberfläche des Agars aufgetragen und die Flüssigkeit wird vorsichtig über die Oberfläche des Agars verteilt Mittel. Der Becher wird leicht geneigt und die überschüssige Kultur wird mit einer Pipette abgesaugt und in die Desinfektionslösung gegossen. Dort wird auch eine Pipette platziert.

Aussaat in Agar. Eine in einem flüssigen Medium oder emulgiertem Material gezüchtete Kultur wird in ein Gefäß mit geschmolzenem, auf 45 °C gekühltem Agar gegeben, gemischt und in eine sterile Petrischale gegossen. Sie können Samen in einen leeren Becher geben und 15–20 ml auf 45 °C abgekühltes Agar hineingießen. Um den Inhalt des Bechers zu vermischen, schütteln und drehen Sie ihn vorsichtig. Die Tassen bleiben auf dem Tisch, bis das Medium aushärtet.

Die mit Samen versehenen Becher werden von unten beschriftet und mit dem Boden nach oben in einen Thermostat gestellt.

Kontrollfragen

1. Sind bei der Aussaat aseptische Bedingungen erforderlich? Rechtfertige deine Antwort.

2. Wie sollte der Arbeitsplatz nach der Aussaat behandelt werden?

Anbaumethoden

Für einen erfolgreichen Anbau sind neben richtig ausgewählten Medien und richtig ausgesätem Saatgut auch optimale Bedingungen erforderlich: Temperatur, Luftfeuchtigkeit, Belüftung (Luftzufuhr). In der Regel können geeignete Bedingungen durch eine sorgfältige Nachbildung der Bedingungen der natürlichen Umwelt geschaffen werden.

Temperatur. Die optimale Temperatur zur Kultivierung der meisten pathogenen Mikroorganismen (37° C) wird in einem Thermostat erzeugt (Abb. 17). Hierbei handelt es sich um ein Gerät mit Doppelwänden, zwischen denen sich elektrisch erwärmte Luft oder Wasser befindet. Es ist mit einem Thermostat ausgestattet, der automatisch die gewünschte Temperatur aufrechterhält, und einem Thermometer zur Überwachung der Temperatur.

Reagenzgläser mit Kulturen in Gestellen, Drahtgeflechten oder Gläsern werden auf die Regale des Thermostats gestellt. Die Tassen im Thermostat sollten auf dem Kopf stehen. Um sicherzustellen, dass die Luft im Thermostat frei zirkulieren kann und die Erwärmung gleichmäßig ist, sind die Einlegeböden im Thermostat mit Schlitzen versehen und nicht zu stark belastet. Um eine Abkühlung des Ernteguts zu vermeiden, bleibt der Thermostat nicht lange geöffnet.

Der Labortechniker muss täglich die Temperatur im Thermostat aufzeichnen und das Gerät sauber halten. Bei Störungen muss ein Techniker gerufen werden.

Licht Die allermeisten Mikroben (einschließlich aller pathogenen) brauchen es nicht – sie werden im Dunkeln kultiviert. Um jedoch die Pigmentbildung zu untersuchen, die bei diffusem Licht aktiver abläuft, werden die Kulturen 2-3 Tage lang in einem Thermostat unter Raumbeleuchtung aufbewahrt.

Aufmerksamkeit! Vermeiden Sie direkte Sonneneinstrahlung, da diese schädliche Auswirkungen auf die Ernte hat.

Feuchtigkeit. Ohne Feuchtigkeit ist mikrobielles Leben nicht möglich – Nährstoffe dringen nur in gelöster Form in die Zelle ein. Dies muss bei der Kultivierung auf festen Substraten berücksichtigt werden: Es ist besser, sie am Tag der Aussaat in Tassen zu füllen und in Reagenzgläsern zu mähen. Bei der Kultivierung von Mikroben, die besonders empfindlich auf Feuchtigkeitsmangel reagieren, wie zum Beispiel Gonokokken, wird ein offenes Gefäß mit Wasser in den Thermostat gestellt.

Kultivierungszeit. Die meisten pathogenen Mikroben werden 18 bis 24 Stunden lang kultiviert, es gibt jedoch Arten, die langsam wachsen (bis zu 4 bis 6 Wochen). Um die Feuchtigkeit darin zu halten, werden Wattestopfen nach der Aussaat durch sterile Gummistopfen ersetzt oder Gummikappen aufgesetzt.

Aufmerksamkeit! Gummistopfen werden in einem in Papier eingewickelten Autoklaven sterilisiert.

Belüftung. Basierend auf dem Bedarf der Mikroben an freiem Sauerstoff werden sie in Aerobier und Anaerobier unterteilt. Beide Gruppen erfordern unterschiedliche Kulturbedingungen.

Die für die Kultivierung von Aerobiern und fakultativen Anaerobiern notwendige Sauerstoffversorgung erfolgt durch passive und aktive Belüftung.

Bei der passiven Belüftung handelt es sich um die Kultivierung auf festen und flüssigen Medien in Gefäßen, die mit Baumwoll- oder Baumwollgaze-Stopfen verschlossen sind, oder in Petrischalen. Während einer solchen Kultivierung verbrauchen Mikroben im Medium gelösten Sauerstoff, der sich im Gefäß über dem Medium befindet und durch den Stopfen eindringt. Passiv belüftete Pflanzen können an der Oberfläche oder in einer dünnen Medienschicht angebaut werden, in die Luftsauerstoff eindringt.

Aktive Belüftung wird für die Tiefenkultivierung von Mikroben verwendet, wenn diese in großen Mengen Medium gezüchtet werden. Um solche Pflanzen ausreichend mit Sauerstoff zu versorgen, werden sie in spezielle Schaukelstühle gesetzt – durch ständiges Rühren der Pflanzen kommt diese mit Luft in Kontakt. Bei der Kultivierung in Flüssigkeitsvolumina von mehreren zehn oder mehreren Hundert Litern, die in Geräten, die Reaktoren oder Fermenter genannt werden, durchgeführt wird, wird mit speziellen Geräten Luft durch die Kultur geblasen.

Anbau von Anaerobiern schwieriger als Aerobier, da ihnen der Zugang zu freiem Sauerstoff aus der Luft verwehrt werden muss. Dazu wird dem Nährmedium auf verschiedene Weise Luft entzogen.

Kultivierung von Actinomyceten, Pilzen, Mykoplasmen, L-Formen, Spirochäten und Protozoen. Die Kultivierung dieser Mikroorganismen ähnelt grundsätzlich der Kultivierung von Bakterien. Für sie wurden spezielle Umgebungen entwickelt und Modi ausgewählt, die ihren Bedürfnissen entsprechen.

Eine Reinkultur ist eine Ansammlung von Mikroben derselben Art auf einem festen oder flüssigen Nährmedium.

Abhängig von den Eigenschaften des untersuchten Materials und dem Zweck der Untersuchung gibt es eine Reihe von Methoden zur Isolierung reiner Kulturen. Typischerweise werden Reinkulturen aus isolierten Kolonien gewonnen – isolierten Mikrobenclustern auf einem festen Medium. Es wird angenommen, dass sich eine Kolonie am häufigsten aus einer einzelnen Mikrobenzelle entwickelt, d. h. es handelt sich um eine Reinkultur dieses Mikroorganismus.

Phasen der Isolierung reiner Kultur:

Tag 1 – Gewinnung isolierter Kolonien. Ein Tropfen des Testmaterials wird mit einer Öse, einer Pipette oder einem Glasstab auf die Oberfläche des Agars in einer Petrischale aufgetragen. Reiben Sie das Material mit einem Spatel in die Oberfläche des Mediums ein. Ohne zu verbrennen oder den Spatel umzudrehen, erst in der 2. und dann in der 3. Tasse säen. Bei einer solchen Aussaat enthält der 1. Becher viel Material und dementsprechend viele Mikroben, der 2. Becher weniger und der 3. Becher noch weniger.

Isolierte Kolonien können durch Schleifensaat gewonnen werden. Dazu wird das Untersuchungsmaterial in Brühe oder isotonischer Natriumchloridlösung emulgiert.

Tag 2 – Untersuchen Sie das Wachstum von Mikroben auf den Tellern. Im 1. Becher findet meist ein kontinuierliches Wachstum statt – die Isolierung einer isolierten Kolonie ist nicht möglich. Auf der Oberfläche des Agars in der 2. und 3. Platte wachsen isolierte Kolonien. Sie werden mit bloßem Auge, mit einer Lupe, bei geringer Vergrößerung eines Mikroskops und manchmal mit einem Stereomikroskop untersucht (siehe Kapitel 31). Die gewünschte Kolonie wird vom Boden der Schale aus markiert und erneut auf eine schräge Agarplatte überimpft. Die Pflanzen werden in einen Thermostat gestellt.

Aufmerksamkeit! Nur isolierte Kolonien können erneut ausgesät werden.

Tag 3 – Studieren Sie das Wachstumsmuster auf Agar-Schrägagar. Sie machen einen Abstrich, färben ihn und beginnen, sie zu studieren, um sicherzustellen, dass die Kultur rein ist. Hier endet die Isolation der Reinkultur. Eine aus einer bestimmten Quelle isolierte und untersuchte Kultur wird als Stamm bezeichnet.

Bei der Isolierung einer Reinkultur aus Blut (Hämokultur) wird diese zunächst in einem flüssigen Medium „gezüchtet“: 10-15 ml steril entnommenes Blut werden in 100-150 ml flüssiges Medium geimpft. Dies geschieht, weil sich im Blut normalerweise nur wenige Mikroben befinden. Das Verhältnis von beimpftem Blut zu Nährmedium von 1:10 ist kein Zufall – so wird eine Blutverdünnung erreicht (unverdünntes Blut wirkt sich schädlich auf Mikroorganismen aus). Die beimpften Kolben werden in einen Thermostat gestellt. Nach einem Tag (manchmal auch nach einer längeren Zeit, abhängig von der zu isolierenden Kultur) wird der Inhalt der Kolben auf Platten beimpft, um isolierte Kolonien zu erhalten. Bei Bedarf die Aussaat im Abstand von 2-3 Tagen wiederholen.

Bei der Isolierung einer Reinkultur aus Urin, Magenspülung und anderen Flüssigkeiten werden diese zunächst unter aseptischen Bedingungen zentrifugiert und das Sediment beimpft. Die weitere Isolierung der Reinkultur erfolgt in üblicher Weise.

Wahlmedien werden häufig zur Isolierung reiner Kulturen verwendet.

Eine Reihe von Methoden nutzen die biologischen Eigenschaften der isolierten Mikrobe, um Reinkulturen zu erhalten. Beispielsweise werden bei der Isolierung sporenbildender Bakterien die Pflanzen 10 Minuten lang auf 80 °C erhitzt, wodurch die vegetativen Formen abgetötet werden; Bei der Isolierung des gegen Säuren und Laugen resistenten Tuberkuloseerregers wird mit diesen Stoffen das Saatgut von der Begleitflora befreit; Um Pneumokokken und Pestbazillus zu isolieren, wird das Testmaterial weißen Mäusen injiziert – in ihrem Körper, der gegenüber diesen Krankheitserregern sehr empfindlich ist, vermehren sich diese Mikroben schneller als andere.

Bei Forschungsarbeiten, insbesondere in der Genforschung, ist es notwendig, Kulturen aus einer einzelnen Zelle zu gewinnen. Diese Kultur wird Klon genannt. Um es zu erhalten, wird am häufigsten ein Mikromanipulator verwendet – ein Gerät, das mit Instrumenten (Nadeln, Pipetten) von mikroskopischer Größe ausgestattet ist. Mithilfe eines Halters werden sie unter der Kontrolle eines Mikroskops in ein hängendes Tropfenpräparat eingebracht, die gewünschte Zelle (eine) entnommen und in ein Nährmedium überführt.

Untersuchung ausgewählter Kulturpflanzen

Die Untersuchung der Morphologie, Motilität, färberischen Eigenschaften (siehe Kapitel 3), der Art des Wachstums auf Medien (kulturelle Eigenschaften), der enzymatischen Aktivität und einer Reihe anderer Merkmale der isolierten Mikrobe ermöglicht es uns, ihre taxonomische Position festzustellen, d. h. den Mikroorganismus zu klassifizieren : Bestimmen Sie seine Gattung, Art, Typ, Subtyp, Sorte. Dies nennt man Identifikation. Die Identifizierung von Mikroorganismen ist für die Diagnose von Infektionen, die Ermittlung von Übertragungsquellen und -wegen sowie für eine Reihe anderer wissenschaftlicher und praktischer Studien von großer Bedeutung.

Kulturgüter

Verschiedene Arten von Mikroorganismen wachsen auf Medien unterschiedlich. Diese Unterschiede dienen ihrer Differenzierung. Einige wachsen gut auf einfachen Medien, andere sind anspruchsvoll und wachsen nur auf speziellen Medien. Mikroorganismen können üppiges, mäßiges oder spärliches Wachstum hervorrufen. Kulturen können farblos, gräulich oder blaugrau sein. Kulturen pigmentbildender Mikroorganismen haben verschiedene Farben: Weiß, Gelb oder Gold für Staphylokokken, Rot für den Wunderstab, Blaugrün für den Blaugrünstab, dessen wasserlösliches Pigment nicht nur die Kolonien färbt , sondern auch die Umwelt.

Eng anliegend In bestimmten Umgebungen bilden Mikroorganismen je nach Menge des Inokulums entweder eine zusammenhängende Schicht („Rasen“) oder isolierte Kolonien. Kulturen können rau und zart, transparent und undurchsichtig sein, mit einer matten, glänzenden, glatten, rauen, trockenen, klumpigen Oberfläche.

Kolonien können groß (4–5 mm Durchmesser oder mehr), mittelgroß (2–4 mm), klein (1–2 mm) und klein (weniger als 1 mm) sein. Sie unterscheiden sich in Form, Lage auf der Oberfläche des Mediums (konvex, flach, kuppelförmig, vertieft, rund, rosettenförmig) und der Form der Kanten (glatt, wellig, schroff).

In Flüssigkeit In Umgebungen können Mikroorganismen eine gleichmäßige Trübung bilden, einen Bodensatz (körnig, staubig, flockig) oder einen Film (zart, rau, faltig) bilden.

Auf halbflüssig In Medien verursachen mobile Mikroben bei der Inokulation mit einem Prick eine Trübung der Dicke des Mediums, während unbewegliche Mikroben nur am „Prick“ wachsen und den Rest des Mediums transparent lassen.

Kulturelle Eigenschaften werden bestimmt, indem man das Wachstumsmuster einer Kultur mit dem einfachen Auge, mit einer Lupe, unter einem Mikroskop mit geringer Vergrößerung oder mit einem Stereomikroskop untersucht. Die Größe und Form der Kolonien, die Form der Ränder und die Transparenz werden im Durchlicht untersucht, indem die Schalen von unten untersucht werden. Im Auflicht (von der Seite des Deckels) werden die Beschaffenheit der Oberfläche und die Farbe bestimmt. Die Konsistenz wird durch Anfassen der Schlaufe bestimmt.

Morphologische Eigenschaften

Das Studium der Morphologie von Mikroben dient auch ihrer Differenzierung. Die Morphologie wird in gefärbten Präparaten untersucht. Bestimmt werden Form und Größe der Zellen, ihre Lage im Präparat, das Vorhandensein von Sporen, Kapseln und Flagellen. In farbigen Präparaten wird das Verhältnis von Mikroben zu Farben bestimmt (färbende Eigenschaften) – sie nehmen Farben gut oder schlecht wahr, was unterschiedliche Flecken betrifft (welche Farbe wird nach Gram, Ziehl-Nielsen usw. gefärbt). Mit der Vitalfärbung (Intravitalfärbung) können Sie Mobilität herstellen, lebende und tote Zellen unterscheiden und deren Teilung überwachen. Teilung und Motilität können in nativen (ungefärbten) Präparaten untersucht werden (siehe Kapitel 3).

Enzymaktivität

Die enzymatische Aktivität von Mikroorganismen ist reichhaltig und vielfältig. Damit können Sie nicht nur die Art und den Typ der Mikrobe bestimmen, sondern auch ihre Varianten (die sogenannten Biovare) bestimmen. Betrachten wir die wichtigsten enzymatischen Eigenschaften und ihre qualitative Bestimmung.

Aufschlüsselung von Kohlenhydraten(saccharolytische Aktivität), d. h. die Fähigkeit, Zucker und mehrwertige Alkohole unter Bildung von Säure oder Säure und Gas abzubauen, wird an Hiss-Medien untersucht, die das eine oder andere Kohlenhydrat und einen Indikator enthalten. Unter dem Einfluss der beim Kohlenhydratabbau entstehenden Säure verändert der Indikator die Farbe des Mediums. Daher werden diese Umgebungen als „bunte Serie“ bezeichnet. Mikroben, die ein bestimmtes Kohlenhydrat nicht fermentieren, wachsen auf dem Medium, ohne es zu verändern. Das Vorhandensein von Gas wird durch die Bildung von Blasen in Medien mit Agar oder durch seine Ansammlung im „Schwimmer“ auf flüssigen Medien festgestellt. Ein „Schwimmer“ ist ein schmales Glasröhrchen mit verschlossenem Ende nach oben, das vor der Sterilisation in ein Reagenzglas mit Medium gegeben wird (Abb. 18).

Reis. 18. Untersuchung der saccharolytischen Aktivität von Mikroorganismen. I – „bunte Reihe“: a – flüssiges Medium mit Kohlenhydraten und Andrede-Indikator; b – halbflüssiges Medium mit einem BP-Indikator: 1 – Mikroorganismen fermentieren keine Kohlenhydrate; 2 – Mikroorganismen fermentieren Kohlenhydrate unter Bildung von Säure; 3 – Mikroorganismen fermentieren Kohlenhydrate unter Bildung von Säure und Gas; II – Kolonien von Mikroorganismen, die sich nicht zersetzen (farblos) und Laktose abbauen (lila auf dem EMC-Medium – links, rot auf dem Endo-Medium – rechts)

Darüber hinaus wird die saccharolytische Aktivität auf Endo-, EMS- und Ploskirev-Medien untersucht. Mikroorganismen, die den in diesen Medien enthaltenen Milchzucker (Laktose) zu Säure fermentieren, bilden farbige Kolonien – die Säure verändert die Farbe des in den Medien vorhandenen Indikators. Kolonien von Mikroben, die keine Laktose fermentieren, sind farblos (siehe Abb. 18).

Milch gerinnt aufgrund des Wachstums von Mikroben, die Laktose fermentieren.

Wenn Mikroorganismen, die Amylase produzieren, auf Medien wachsen, die lösliche Stärke enthalten, wird Stärke abgebaut. Dies erfahren sie, indem sie der Kultur einige Tropfen Lugols Lösung hinzufügen – die Farbe des Mediums ändert sich nicht. Unverdaute Stärke verleiht dieser Lösung eine blaue Farbe.

Proteolytische Eigenschaften(d. h. die Fähigkeit, Proteine, Polypeptide usw. abzubauen) wird auf Medien mit Gelatine, Milch, Molke und Pepton untersucht. Wenn Mikroben, die Gelatine fermentieren, auf einem Gelatinemedium wachsen, verflüssigt sich das Medium. Die Art der durch verschiedene Mikroben verursachten Verflüssigung ist unterschiedlich (Abb. 19). Mikroben, die Kasein (Milchprotein) abbauen, bewirken eine Peptonisierung der Milch – sie nimmt das Aussehen von Molke an. Beim Abbau von Peptonen können Indol, Schwefelwasserstoff und Ammoniak freigesetzt werden. Ihre Entstehung wird anhand von Indikatorpapieren bestimmt. Filterpapier wird mit bestimmten Lösungen vorimprägniert, getrocknet, in schmale Streifen von 5-6 cm Länge geschnitten und nach der Aussaat der Kultur auf dem MPB unter einen Stopfen zwischen diesem und der Wand des Reagenzglases gelegt. Nach der Inkubation im Thermostat wird das Ergebnis berücksichtigt. Ammoniak führt dazu, dass Lackmuspapier blau wird; Wenn Schwefelwasserstoff auf einem mit einer 20 %igen Lösung aus Bleiacetat und Natriumbicarbonat getränkten Stück Papier freigesetzt wird, entsteht Bleisulfat – das Papier wird schwarz; Indol verursacht eine Rötung eines mit einer Oxalsäurelösung getränkten Blattes Papier (siehe Abb. 19).

Zusätzlich zu diesen Medien wird die Fähigkeit von Mikroorganismen, verschiedene Nährsubstrate abzubauen, mithilfe von mit bestimmten Reagenzien imprägnierten Papierscheiben (Papierindikatorsystemen „SIB“) bestimmt. Diese Scheiben werden mit der zu untersuchenden Kultur in Reagenzgläser gesenkt und nach 3-stündiger Inkubation in einem Thermostat bei 37 °C wird der Abbau von Kohlenhydraten, Aminosäuren, Proteinen usw. anhand der Farbveränderung der Scheiben beurteilt.

Hämolytische Eigenschaften (die Fähigkeit, rote Blutkörperchen zu zerstören) werden in Blutmedien untersucht. In diesem Fall werden flüssige Medien transparent und auf dichten Medien erscheint eine transparente Zone um die Kolonie (Abb. 20). Bei der Bildung von Methämoglobin verfärbt sich das Medium grün.

Erhaltung der Kulturen

Isolierte und untersuchte Kulturen (Stämme), die für die Wissenschaft oder Produktion wertvoll sind, werden in Museen lebender Kulturen aufbewahrt. Das All-Union-Museum befindet sich im nach ihm benannten Staatlichen Forschungsinstitut für Standardisierung und Kontrolle medizinischer biologischer Präparate. L. A. Tarasevich (GISK).

Der Zweck der Lagerung besteht darin, die Lebensfähigkeit von Mikroorganismen zu erhalten und ihre Variabilität zu verhindern. Dazu ist es notwendig, den Austausch in der mikrobiellen Zelle zu schwächen oder zu stoppen.

Eine der fortschrittlichsten Methoden zur Langzeitkonservierung von Kulturen ist die Lyophilisierung. Durch das Trocknen im Vakuum aus dem gefrorenen Zustand können Sie einen Zustand schwebender Animation erzeugen. Die Trocknung erfolgt in speziellen Geräten. Lagern Sie Kulturen in verschlossenen Ampullen bei einer Temperatur von 4 °C, vorzugsweise bei -30–70 °C.

Wiederherstellung von Trockenfrüchten. Erhitzen Sie die Spitze der Ampulle kräftig in der Flamme des Brenners und berühren Sie sie mit einem leicht mit kaltem Wasser angefeuchteten Wattestäbchen, sodass sich Mikrorisse auf dem Glas bilden, durch die langsam Luft in die Ampulle eindringt. Gleichzeitig wird die Luft durch die erhitzten Rissränder sterilisiert.

* (Befindet sich überschüssiges Wasser auf dem Tampon, kann es in die Ampulle gelangen und die Sterilität der Kultur stören: Es wird durch die gebildeten Mikrorisse angesaugt, da in der Ampulle ein Vakuum herrscht.)

Aufmerksamkeit! Vergessen Sie nicht, dass in der versiegelten Ampulle ein Vakuum herrscht. Wenn durch ein großes Loch sofort Luft eindringt, kann die Kultur in der Ampulle versprüht und ausgeworfen werden.

Lassen Sie Luft eindringen, brechen Sie schnell den oberen Teil der Ampulle mit einer Pinzette ab und entfernen Sie sie. Verbrennen Sie das Loch leicht und geben Sie mit einer sterilen Pasteurpipette oder Spritze ein Lösungsmittel (Brühe oder isotonische Lösung) in die Ampulle. Mischen Sie den Inhalt der Ampulle und inokulieren Sie das Medium damit. Das Wachstum wiederhergestellter Pflanzen kann in den ersten Anpflanzungen verlangsamt werden.

In speziellen Geräten können Pflanzen auch in flüssigem Stickstoff (-196° C) über einen längeren Zeitraum konserviert werden.

Methoden zur kurzfristigen Konservierung von Kulturen sind wie folgt: 1) Subkultivierung (periodische Neuaussaat auf frischem Medium) in Abständen, abhängig von den Eigenschaften des Mikroorganismus, des Mediums und der Kultivierungsbedingungen. Zwischen den Neupflanzungen werden die Kulturen bei 4 °C gelagert; 2) Konservierung unter einer Ölschicht. Die Kultur wird in Agar in einer 5-6 cm hohen Säule gezüchtet, mit steriler Vaseline gefüllt (Ölschicht ca. 2 cm) und senkrecht im Kühlschrank gelagert. Die Haltbarkeit verschiedener Mikroorganismen ist unterschiedlich, daher wird die Kultur regelmäßig aus den Reagenzgläsern ausgesät, um ihre Lebensfähigkeit zu überprüfen; 3) Lagerung bei -20–70 °C; 4) Lagerung in verschlossenen Röhrchen. Bei Bedarf wird das gelagerte Material auf frische Substrate ausgesät.

Kontrollfragen

1. Was beinhaltet der Begriff „bakteriologische Forschung“?

2. Wie sollte die Kultur für eine solche Forschung sein?

3. Was ist eine mikrobielle Kolonie, Kultur, Stamm, Klon?

4. Was beinhaltet das Konzept der „kulturellen Eigenschaften von Mikroben“?

Übung

1. Studieren und beschreiben Sie mehrere Kolonien. Übertragen Sie sie auf Agar-Schrägagar und in einen Sektor.

2. Studieren und beschreiben Sie das Wachstumsmuster der Kultur auf Schrägagar. Bestimmen Sie die Reinheit und Morphologie der Kultur im gefärbten Präparat.

3. Übertragen Sie die Kultur vom Schrägagar auf die Brühe und die Differentialdiagnosemedien. Studieren Sie das Wachstumsmuster der Kultur auf diesen Medien und ihre enzymatischen Eigenschaften und halten Sie sie im Protokoll fest.